观察兔前交叉韧带(ACL)不同部位部分损伤后ACL内本体感受器形态和功能的变化，并探讨其机制。
共选用28只新西兰大白兔作为实验动物，按数字表法随机分为3组，其中A、B组各12只，分别于兔单侧ACL中部和ACL近胫骨1/3处制作部分损伤，对照组4只不进行手术操作。对照组于实验后2个月，A、B组均于实验后2、4、6个月各取4只兔行体感诱发电位和腘绳肌肌电图检测，之后取ACL行氯化金染色检查，评估韧带内神经组织形态及功能情况。
A组和B组随着观察时间延长，其体感诱发电位和肌电图的潜伏期逐渐延长和波幅逐渐下降；A、B组与对照组相比较，其损伤侧膝关节的肌电图和体感诱发电位的潜伏期及波幅差异均有统计学意义(P值均<0.05)，而A组与B组各相应时间点之间差异均无统计学意义(P值均>0.05)。A、B组随着观察时间延长，ACL内本体感受器数量逐渐减少，异形的本体感受器增多、体积缩小；A组和B组ACL内本体感受器数量均较对照组下降，差异均有统计学意义(P值均<0.05)，而A组与B组各相应时间点之间比较，差异均无统计学意义(P值均>0.05)。
ACL不同部位的损伤均会导致韧带内本体感受器数量减少、形态异常及本体感觉下降，且不同部位的损伤导致的本体感受器及本体感觉变化无差异，其机制可能与韧带内血管对总体血供影响不大有关。
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膝关节本体感觉传入神经来源丰富，主要分布于关节囊、韧带、滑膜和肌肉等[1]。研究发现，前交叉韧带(anterior cruciate ligament, ACL)中传入神经纤维是维持膝关节本体感觉正常功能的重要结构[2]。ACL损伤后不但导致膝关节失去生物力学稳定性，更会导致关节相应本体感觉的损伤[3]。ACL损伤可以发生于韧带任何位置，但主要发生于韧带中部，其次为股骨附着点撕脱或胫骨附着点撕脱。对ACL的基础研究发现，韧带血供主要来源于滑膜及韧带内血管，且韧带各部位的血供是不均一的，韧带中央区血供较外周区血供差[4]。已有研究发现，剥去兔ACL上的滑膜组织，术后2周ACL出现萎缩[5]。然而，关于ACL不同位置损伤后韧带内本体感受器变化的研究却十分少见。本研究通过建立新西兰大白兔ACL不同部位部分损伤模型，观测单侧ACL不同位置的大部损伤后不同时间点的韧带内本体感受器形态及功能变化。
取健康新西兰大白兔28只，雌雄不分，体质量2.0～2.5 kg，兔龄6个月左右，购自浙江省医院科学院，许可证号：SCXK(浙)2008–0033。1%氯化金溶液、88%甲酸、甘油、新鲜柠檬汁、轮转式切片(RM2135型，LEICA公司)、光学显微镜(BH2型，OLYMPUS公司)、诱发电位仪(MEB2200型日本光电)。
共选用28只新西兰大白兔作为实验动物，按数字表法随机分为3组，其中A组于ACL中部部分损伤，12只；B组于ACL近胫骨处1/3处部分损伤，12只；对照组不进行手术操作，4只。
使用3%戊巴比妥1 mL/kg于单侧耳缘静脉注射麻醉后，将兔固定于手术台，固定头部及四肢，手术侧行去毛消毒备皮，铺无菌单。行膝关节正中髌旁内侧入路，切开皮肤，仔细分离筋膜、肌肉并止血。30 ℃生理盐水冲洗伤口，保持创口湿润。松解软组织至可较轻松向外侧推开髌骨，暴露膝关节腔，清理部分髌下脂肪垫至能方便操作ACL。ACL切断3/4(A组损伤部位为韧带中部，B组损伤部位为韧带近胫骨附着点的1/3处)，余1/4仍然连接到股骨和胫骨。30 ℃生理盐水冲洗关节腔和手术切口，彻底止血，逐层缝合伤口。关闭伤口后碘酒消毒，青霉素钠粉末撒于伤口表面，无菌纱布覆盖。术前及术后3 d内每日肌内注射青霉素10万U，术后3 d内每日换药1次。手术后每只兔分笼喂养，常规饲料外加新鲜蔬菜饲养。分别于术后第2、4、6个月末选取A组及B组各4只兔，对其损伤侧膝关节进行电生理检测(肌电图及体感诱发电位)，之后使用空气栓塞法处死取损伤侧ACL进行氯化金染色。对照组仅与A、B组术后2个月末同时进行检测及处死取材。
处死实验动物后，切断ACL的股骨及胫骨附着处，完整取出ACL，采用改良氯化金染色[6]检测韧带内本体感受器的数量和形态。具体过程如下：ACL放置于甲酸＋新鲜柠檬汁混合液中(88%甲酸∶柠檬汁为1∶3)，于暗室、室温下放置15 min；取出标本，滤纸吸干表面液体，放入1%氯化金溶液中，在暗室、室温下放置30 min；再使用滤纸吸干标本表面液体，放入25%甲酸溶液，暗室中放置15 h。标本使用双蒸水冲洗至少1 h后放入甘油中保存1 d以上；乙醇常规梯度脱水、二甲苯透明，使用石蜡包埋，切制呈厚15 mm的切片，行光学显微镜观察。每个标本行连续切片，石蜡切片按顺序排列摆放，标记ACL的股骨端、中间部、胫骨端，对本体感受器进行分辨和计数。
对实验兔行乙醚吸入＋1%利多卡因局部麻醉后，固定头部及四肢，采用髌旁内侧入路进入关节腔显露ACL。记录电极点放置在头正中矢状线与两眶后缘的连线交点旁开0.2 cm、后移0.5 cm处。鼻根部皮下放置皮层参考电极，下肢近端放置皮下电极接地，之后记录体感诱发电位(somatosensory evored potential, SEPs)。随后将记录电极置于腘绳肌肌腹内，内踝放置参考电极，进行肌电图(electromyograns, EMG)检查。双极表面电极于ACL两侧近骨端处进行电刺激，强度为18～20 V。使用日本光电MEB2200型诱发电位仪记录SEPs和EMG，信号输入计算机操作系统，分析SEPs和EMG的潜伏期和波幅。
应用SPSS 19.0统计软件对实验数据进行统计学分析。近似服从正态分布的计量资料使用
±s表示。各组间比较采用方差分析，方差分析前均行K-S检验进行正态性检验及Bartlett检验进行方差齐性分析。以P<0.05为差异有统计学意义。
光学显微镜观测到4种类型神经末梢结构：Golgi类腱体、Ruffini小体、Pacinian小体和游离神经末梢(图1、图2、图3、图4)。神经末梢结构主要发现于ACL两端的骨附着点附近，并以股骨端附近居多。A组ACL损伤后第2、4、6个月末观察到损伤侧韧带内的本体感受器随损伤时间延长，其内经典感受器结构逐渐减少，而非典型结构出现比例却逐渐增高，总数量逐渐减少(图5、图6、图7)。B组的ACL内本体感受器的形态与数量同样也出现上述情况。在不同观察时间点，A、B两组间韧带内本体感受器数量比较，差异均无统计学意义(P值均>0.05)；A、B组本体感受器数量均较对照组明显减少，差异均有统计学意义(P值均<0.01)，见表1。
对照组及A、B组兔前交叉韧带韧带损伤后不同时间本体感受器计数比较(
±s)
对照组及A、B组兔前交叉韧带韧带损伤后不同时间本体感受器计数比较(±s)
| 组别 | 2个月(4例) | 4个月(4例) | 6个月(4例) |
| 对照组 | 28.25±1.70 | 28.25±1.70b | 28.25±1.70b |
| A组 | 17.00±1.41a | 13.75±1.71a | 9.50±1.73a |
| B组 | 16.25±1.50a | 14.75±3.50a | 10.00±1.83a |
| F值 | 75.663 | 43.521 | 148.081 |
| P值 | <0.01 | <0.01 | <0.01 |
注：A组：前交叉韧带中部大部损伤模型组；B组：前交叉韧带近胫骨1/3处大部损伤模型组。与对照组比较，aP<0.01；b引用对照组2个月数据
A、B组韧带损伤后2个月即发现SEPs和EMG的潜伏期延长、波峰降低，且随时间流逝，潜伏期呈现逐渐延长、波幅逐渐下降的趋势；A组与B组之间差异均无统计学意义(P值均>0.05)，而A、B组较对照组的SEPs及EMG潜伏期长、波峰峰值低，各时间点比较，差异均有统计学意义(P值均<0.05)。见表2。
对照组及A、B组兔ACL韧带损伤后不同时间SEPs和EMG潜伏期和波幅变化比较(
±s)
对照组及A、B组兔ACL韧带损伤后不同时间SEPs和EMG潜伏期和波幅变化比较(±s)
| 组别 | SEPs | |||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 潜伏期(ms) | 波幅(μV) | |||||||
| 2个月(4例) | 4个月(4例) | 6个月(4例) | 2个月(4例) | 4个月(4例) | 6个月(4例) | |||
| 对照组 | 14.90±1.99 | 14.90±1.99b | 14.90±1.99b | 20.88±3.12 | 20.88±3.12b | 20.88±3.12b | ||
| A组 | 21.00±3.55a | 25.15±2.73a | 30.03±3.24a | 13.95±3.25a | 6.73±1.39a | 6.13±1.25a | ||
| B组 | 21.33±4.51a | 24.28±3.20a | 29.88±3.18a | 14.25±2.37a | 6.925±2.16a | 6.38±1.71a | ||
| F值 | 4.262 | 17.877 | 36.905 | 7.086 | 48.033 | 60.204 | ||
| P值 | <0.05 | <0.01 | <0.01 | <0.05 | <0.01 | <0.01 | ||
| 组别 | EMG | |||||||
| 潜伏期(ms) | 波幅(μV) | |||||||
| 2个月(4例) | 4个月(4例) | 6个月(4例) | 2个月(4例) | 4个月(4例) | 6个月(4例) | |||
| 对照组 | 6.98±2.24 | 6.98±2.24b | 6.98±2.24b | 0.49±0.02 | 0.49±0.02b | 0.49±0.02b | ||
| A组 | 12.48±2.06a | 17.85±4.82a | 19.25±4.36a | 0.31±0.013a | 0.22±0.26a | 0.20±0.01a | ||
| B组 | 12.45±1.81a | 18.33±3.80a | 19.18±4.58a | 0.30±0.073a | 0.23±0.068a | 0.19±0.04a | ||
| F值 | 9.579 | 11.611 | 13.290 | 24.661 | 52.792 | 153.143 | ||
| P值 | <0.01 | <0.01 | <0.01 | <0.01 | <0.01 | <0.01 | ||
注：ACL：前交叉韧带；SEPs：体感诱发电位；EMG：肌电图。A组：前交叉韧带中部大部损伤模型组；B组：前交叉韧带近胫骨1/3处大部损伤模型组。与对照组2个月比较，aP<0.01；b引用对照组2个月数据
膝关节本体感觉对于维持膝关节运动功能、预防运动损伤具有重要作用。本体感觉通过提供关节运动及位置信息，经过相应神经环路反馈至运动皮层，再通过调节γ运动元来控制关节周围肌肉肌梭的反射系统，从而协助肌肉肌张力控制及肌肉收缩[7]。早在1984年，Schult等[8]通过氯化金染色法对人ACL进行观察，并对其内本体感受器进行描述。此后对ACL的神经生理方面投入大量研究。ACL不仅仅是维持膝关节机械稳定的重要结构，同时经基础研究证实，ACL内的传入神经纤维是膝周围神经环路中重要构成部分，对维持膝关节正常步态有重要意义[9]。Freeman等[6]改进氯化金染色法，简化了操作步骤，并用此法对ACL进行检测，并描述了4种神经组织：Ruffini小体、Pacinian小体、Golgi类腱体和游离神经末梢，除此之外并提出ACL的神经生理功能与其生物力学功能同样重要。Adachi等[10]通过关节镜检测对残留ACL进行病理检测，发现术前患者本体感觉与韧带内本体感受器数量呈正相关，但未注明损伤时间和感受器形态。
ACL损伤后会造成该侧膝关节本体感觉的受损已成为现学界共识。研究表明，通过被动活动感觉阈值实验或关节位置感觉检测两种方法对损伤侧膝关节进行检测，以对侧肢体作为对照组，两种方法均发现受损侧本体感觉有明显缺失[11,12,13,14]。Relph等[15]通过对关于ACL损伤研究的荟萃分析，结果发现ACL损伤后损伤侧本体感觉相对于对侧肢体及健康肢体均有明显下降。
ACL的营养供给主要来自以下三方面：韧带内血管、滑膜血管网和滑液营养，其中以滑膜血管网供给最为重要，其次为韧带内血管，再次为滑液[16]；而骨韧带附着处血管很少与韧带内血管有交通支。Aim等[16,17]以犬作为实验动物，通过墨汁灌注法发现ACL中部区血管相对缺乏，骨附着处血管与韧带血管鲜有交通，韧带血供以滑膜供血为主。Claney等[18]研究发现，猕猴的ACL外包滑膜，滑膜血管来源于髌下脂肪垫和后方的滑膜皱襞，其分支穿入韧带内，与韧带内血管构成交通，其骨内血管与韧带无交通。Robinson等[19]通过对兔ACL进行定量灌流发现，ACL滑膜血流量与韧带实质血流量比例为2∶1，移除髌下脂肪垫后血流量下降一半，ACL移除滑膜后2周观察到韧带萎缩。
维持韧带内本体感受器正常形态与功能需要依靠合适的机械刺激、充足的血供和完整的神经通路。而韧带中部存在乏血管区，理论上此处的损伤相较于其他部位的损伤对韧带血供的影响相对较小，对韧带内本体感受器更小。然而，本研究发现韧带中部损伤对本体感受器影响较其他部位损伤小，本体感受器形态与数量上的减少趋势并无明显差异，电生理检测也发现同样趋势。出现此现象可能有以下两个原因：(1)韧带内血管对于韧带供给而言并非占主要位置，而以滑膜血管网为主，而且滑膜血管网交通支丰富，只要滑膜损伤不明显，韧带中部损伤和其他部位损伤对韧带本身血供并无明显影响。(2)不论ACL哪个部位大部损伤，都会造成韧带强度明显下降并造成神经通路损伤，导致本体感受器无法受到合适的机械刺激，再加上神经通路的损伤，导致本体感受器数量减少和形态异常。
本研究存在以下不足：(1)样本量相对较少；(2)虽电生理检测是目前检测动物本体感觉的主要方法，但其不能排除中枢神经系统及麻醉深度影响结果的可能，可能会因此导致实验结果的误差。
总之，本研究发现ACL不同部位的大部损伤均会导致韧带内本体感受器出现数量减少和形态异常，且不同部位的损伤导致的本体感受器变化并无明显差异，其机制可能与韧带内血管对总体血供影响不大有关，此结果需进一步研究予以证实。
