探讨盲肠结扎穿孔(CLP)、腹腔持续置管引流(CASP)脓毒症模型小鼠血清白细胞介素-6(IL-6)与其早期生存率的关系。
将60只雄性BALB/c小鼠编号，采用数字表法随机分为3组，即假手术组(Sham组)、CLP组、CASP组，各20只。CLP组小鼠麻醉后，于中下腹正中线做纵行切口，充分暴露并结扎盲肠，用18 G注射器针头在结扎部位远端穿孔并来回贯穿2次，将少量肠内容物挤出，回纳盲肠，缝合腹壁切口。CASP组术前准备、开腹方式同CLP模型，暴露小鼠升结肠系膜，在其对侧处插入静脉导管，退出针芯，荷包缝合并固定、剪断静脉导管，将游离端放置于腹腔内。用棉签挤压肠管，使少量肠内容物从导管口溢出，以确认导管通畅。Sham组术前准备、开腹、术后处理同CLP组，不行盲肠结扎、穿孔。观察各组小鼠术后12、24、36、48、60、72 h的生存率。术后6 h采集各组小鼠尾静脉血，采用ELISA检测血清IL-6，比较此时间点3组存活小鼠间IL-6水平以及CLP组、CASP组的存活和死亡小鼠间IL-6水平。
Sham组、CLP组和CASP组术后72 h生存率分别是100.0%(20/20)、45.0%(9/20)和10.0%(2/20)，3组间总体比较差异有统计学意义(χ2＝32.970，P<0.01)，两两比较3组间差异均有统计学意义(P值均<0.05)；3组小鼠生存时间曲线经Log-rank检验，差异有统计学意义(χ2＝34.030，P<0.05)。术后6 h，Sham组、CLP组、CASP组存活小鼠血清IL-6水平分别是(36.62±10.30)ng/L、(2 443.47±970.50)ng/L、(4 057.93±827.41)ng/L，差异均有统计学意义(Hc＝29.270，P<0.01)；CLP组和CASP组各组内存活小鼠血清IL-6水平平均分别为(1 348.80±276.25)ng/L、2 100.00 ng/L，明显低于死亡小鼠的(3 157.29±330.94)ng/L、(4 275.48±512.71)ng/L，CLP组差异有统计学意义(t＝13.071，P<0.01)。
两种脓毒症模型小鼠的转归都有一定的病死率，较好地模拟了脓毒症的病理生理过程，CLP模型侧重于模拟局限性腹腔脓肿，CASP模型则侧重于模拟弥漫性腹膜炎。CLP组模型术后6 h血清IL-6水平较低的小鼠，术后72 h生存率较高。
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脓毒症是因感染引起的全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome, SIRS)，也是烧伤、创伤、感染、休克等临床急危重症患者的严重并发症之一，到目前为止仍是危重症病人死亡的主要原因。脓毒症动物模型是研究脓毒症发病机制和改善临床防治方式必须的实验平台，建立更贴近临床实际的脓毒症动物模型具有重要意义。传统的盲肠结扎穿孔模型(cecal ligation and puncture, CLP)因为与脓毒症患者临床表现的相似性，对脓毒症病理生理过程极好的模拟性，被认为是研究脓毒症的金标准[1]。在基于CLP模型的研究过程中发现，众多细胞因子中白细胞介素-6(interleukin-6, IL-6)的水平与小鼠的生存率密切相关，且在术后6 h时IL-6就有明显升高[2]。与CLP模型相似，腹腔置管持续引流模型(colon ascendens stent peritonitis, CASP)也是一种用于脓毒症研究的实验动物模型。2010年，Traeger等[3]通过视频对CASP的操作步骤做了详细的示范讲解。2012年7月–2014年5月笔者通过比较这两种实验动物模型，以及检测其术后6 h的血清IL-6水平的前瞻性研究，拟为脓毒症的临床研究提供更加合适的动物模型，并初步探索在这两种脓毒症模型小鼠血清IL-6与其早期生存率的关系。
SPF级雄性BALB/c小鼠60只，购自中国医学科学院实验动物研究所，实验动物质量合格证号SCXK(京) 2009-0004，鼠龄6～8周，体质量20～25 g。实验前小鼠分笼饲养，每笼5只，依次进行编号，自由进食饮水，于实验环境中适应3～4 d，体质量达25～30 g时开始实验。实验环境温度控制在(25±2)℃，小鼠腹部脱毛[4]。将60只小鼠按照数字表法随机分为假手术组(Sham组)、CLP组和CASP组，各20只。18 G静脉导管购自美国BD公司。
制作标准参照Rittirsch等[5]报道的方法。小鼠腹部脱毛，术前8 h禁食，自由饮水。术前称体质量，按0.1 mL/10 g剂量腹腔注射戊巴比妥钠麻醉(质量浓度6.7 mg/mL)。腹部消毒，于小鼠中下腹正中线行1～2 cm纵行切口，充分暴露盲肠，在回盲瓣和盲肠游离端的中部结扎，保留近端盲肠血供。用18 G注射器针头在结扎部位远端穿孔并来回贯穿2次，将少量肠内容物挤出。回纳盲肠，缝合腹壁切口，并于小鼠背部皮下注射37 ℃生理盐水3 mL复苏。术后动物仍分笼饲养，自由进食饮水。(2)CASP组：制作标准参照Traeger等[3]报道的方法。术前准备、开腹、术后处理同CLP模型。在小鼠升结肠系膜对侧(距离回盲瓣1.0～1.5 cm)处插入静脉导管，有落空感时表示穿透肠壁，退出针芯。使静脉导管插入肠管内大约1 mm(术前标记)，荷包缝合并固定静脉导管，距离荷包缝合处约3 mm剪断静脉导管，将游离端放置于腹腔内。用棉签挤压肠管，使少量肠内容物从导管口溢出，以确认导管通畅。(3)Sham组：术前准备、开腹、术后处理同CLP组，不行盲肠结扎、穿孔。
(1)观察小鼠术后一般情况，包括活动度、外观、尸体解剖的腹内情况等。(2)观察术后12、24、36、48、60、72 h生存情况，术后72 h仍存活的设为存活组，反之为死亡组。比较Sham组、CLP组、CASP组的生存率。(3)术后6 h分别对Sham组、CLP组、CASP组中存活小鼠的尾静脉采血，应用ELISA检测血清IL-6水平(ELISA试剂盒购自北京中科生物公司)，比较3组小鼠术后6 h血清IL-6水平。再将CLP组和CASP组各自的生存小鼠和死亡小鼠在术后6 h的血清IL-6水平进行统计学分析。
应用统计SPSS 16.0对数据进行统计学分析。各组计量资料均服从正态分布，采用
±s表示，2组比较采用独立样本t检验，方差不齐时采用秩和检验，其中两两比较采用Bonferroni校正后的检验水准(P＝0.05/3≈0.02)。计数资料采用χ2检验，生存时间曲线分析采用Log-rank检验。除两两比较，其他分析均以P<0.05为差异有统计学意义。
Sham组小鼠术后活动自如，正常进食饮水。CLP组和CASP组小鼠术后表现相似，术后12 h内出现毛发松乱，精神萎靡，呼吸加快，对外界反应迟钝；24～36 h可见尿液混浊，肛门处有粪便附着，粪便性状不定；眼部有不同程度的脓性分泌物，眼睑粘连。术后72 h后进行尸体解剖，可见CLP组小鼠腹腔内出现脓肿包裹，有混浊渗出液；CASP组小鼠腹腔脏器充血水肿明显，肠管粘连，小肠充气，有混浊渗出液，但未见明显脓肿包裹形成。
术后72 h观察时间内，未见Sham组小鼠死亡。CLP组和CASP组12、24、36、48、60、72 h存活的小鼠数量分别为19、13、12、11、10、9只和18、8、5、4、4、2只。Sham组、CLP组和CASP组术后72 h生存率分别是100.0%、45.0%和10.0%，差异有统计学意义(χ2＝32.970, P<0.01)，率的两两比较显示，3组间差异均有统计学意义(P值均<0.05)。3组小鼠生存时间曲线经Log-rank检验，差异有统计学意义(χ2＝34.030, P<0.05)，见图1。
Sham组、CLP组、CASP组术后6 h存活小鼠血清IL-6水平差异均有统计学意义(Hc＝29.270, P<0.01)，见表1。CLP组和CASP组各自的存活小鼠在术后6 h的血清IL-6水平均低于死亡小鼠，CLP组差异有统计学意义(P<0.01)，CASP组因存活小鼠仅2只，不予统计分析。见表2。
Sham 组、CLP组、CASP组术后6 h生存小鼠血清IL-6水平的比较(
±s)
Sham 组、CLP组、CASP组术后6 h生存小鼠血清IL-6水平的比较(±s)
| 组别 | 例数(只) | IL-6(ng/L) |
|---|---|---|
| Sham组 | 20 | 36.62± 10.30 |
| CLP组 | 19 | 2 443.47±970.50a |
| CASP组 | 18 | 4 057.93±827.41ab |
| Hc值 | – | 29.270 |
| P值 | – | <0.01 |
注：Sham组：假手术组；CLP组：盲肠结扎穿孔模型；CASP组：腹腔置管持续引流模型；IL-6：白细胞介素-6。两两比较采用Bonferroni检验，与Sham组比较，aP<0.02；与CLP组比较，bP<0.02
CLP 组和CASP组存活小鼠与死亡小鼠术后6 h血清IL-6水平比较(
±s)
CLP 组和CASP组存活小鼠与死亡小鼠术后6 h血清IL-6水平比较(±s)
| 组别 | 例数(只) | IL-6(ng/L) | |
|---|---|---|---|
| CLP组 | |||
| 存活小鼠 | 9 | 1 348.80±276.25 | |
| 死亡小鼠 | 11 | 3 157.29±330.94 | |
| t值 | – | 13.071 | |
| P值 | – | <0.01 | |
| CASP组 | |||
| 存活小鼠 | 2 | 2 100.00a | |
| 死亡小鼠 | 18 | 4 275.48±512.71 | |
注：CLP组：盲肠结扎穿孔模型；CASP组：腹腔置管持续引流模型；IL-6：白细胞介素-6；a示平均数值
动物模型是脓毒症研究的重要平台，随着对脓毒症病理生理过程认识的深入，动物模型也越来越多样化。常用的动物模型有内毒素血症模型，CLP模型，以及CASP模型[6]。CLP模型更是被许多研究者称为是脓毒症模型的金标准；但是此模型制作过程中存在标准化的问题，Rittirsch等[5]报道，CLP术中所结扎的盲肠长度，盲肠内粪便体积，穿孔的大小等因素对模型生存率有重要的影响。CASP模型是新出现的一种脓毒症模型，不涉及盲肠结扎问题，只需要控制引流管的管径大小，模型变异性小，重复性好[7,8]。本实验对CLP和CASP这两种脓毒症模型进行了初步比较，术后72 h尸体解剖可见CLP组小鼠腹腔内出现脓肿包裹，CASP组小鼠腹腔脏器充血水肿明显、肠管粘连、小肠充气，但未见明显脓肿包裹形成。提示这两种模型模仿了脓毒症两种不同的病理生理过程。CLP模型侧重于模仿局限性腹腔脓肿形成的脓毒症，CASP模型则侧重于模仿弥漫性腹膜炎形成的脓毒症[7,9]。
脓毒症是临床上病死率较高的疾病，因此脓毒症模型的转归会有一定数量的病死率。本实验术后72 h，CLP组生存率为45.0%(9/20)，CASP组生存率仅为10.0%(2/20)，符合脓毒症模型的要求[7]。在没有给予干预措施的情况下，早期脓毒症的死亡可能是由于失控性炎症反应或过度免疫抑制造成。将两种情况区分，给予对症治疗，是提高脓毒症患者生存率的重点[2,10]。有报道称，在脓毒症早期血清IL-6水平急剧升高，提示机体发生了SIRS。对于这类患者，给予抗炎治疗；反之给予增强自身免疫反应的治疗。但IL-6并未直接参与此过程中的器官损伤，只是炎症反应严重程度的指标[2,11]。临床研究也证实，高血清IL-6水平的危重症患者病死率极高[12]。而由于血清IL-6水平在脓毒症后期逐渐下降，所以血清IL-6水平是早期预测患者生存率的重要指标[13,14]。动物实验研究证明，CLP术后选择性阻断IL-6的生成，可以提高小鼠的生存率[15]，这一点在对脓毒症患者的治疗过程中也得到了证实[16]。本实验中，对术后6 h外周血IL-6水平的检测显示，Sham组明显低于CLP组和CASP组，而CLP组明显低于CASP组，与术后72 h所得出的生存率相对应。将CLP组和CASP组各自术后72 h的存活小鼠与死亡小鼠进行比较，存活小鼠的血清IL-6水平在术后6 h明显低于死亡小鼠。这些结果与以上临床报道[15]一致，提示这两种模型能够较好地反映部分脓毒症患者的病理生理情况，且早期血清低水平IL-6的小鼠，生存率较高。然而，也有动物研究证实，IL-6在某些脓毒症类型中表现出积极的作用。例如在B族链球菌感染导致的脓毒症小鼠体内，高IL-6水平被认为对小鼠有保护作用[2]。IL-6在小鼠体内的不同作用效果，可能与导致脓毒症的原发疾病有关系。这更加提示正确选取脓毒症模型的重要性[2]，否则有可能得出完全相反的结论。
本研究中虽然采用了两种不同的动物模型，但是与目前临床上不同基础疾病所导致的脓毒症相比，仍然有非常大的局限性。在临床上正确判断脓毒症的原发疾病，早期合理利用血清IL-6水平判断体内炎症发展情况，给予及时的干预治疗，对于提高脓毒症患者的生存率十分重要。作为基础研究者，需要进一步多元化地发展脓毒症动物模型，不能将某一种模型作为所有类型的脓毒症研究的金标准，以求得出更有利于临床治疗发展的科研成果[17]。
