总结干细胞组织工程构建先天性心脏病(先心病)外科重建材料的研究进展。
在万方数据、PubMed数据库查阅2005年1月—2014年12月与先心病、干细胞、组织工程及外科重建研究相关的文献，进行汇总分析。
成体干细胞，特别是骨髓来源的间充质干细胞已经成功用于体外构建先心病外科重建材料的研究，在羊、狗等大动物实验中取得良好的结果，并应用于临床单心室的外科重建研究，临床效果满意。胚胎干细胞增殖能力旺盛，在体外能够分化为有功能的心肌细胞和内皮细胞，构建的组织工程心肌具备了新生儿心肌组织的特点。诱导多能干细胞具有胚胎干细胞相似的全能性，且不存在伦理问题，是非常有前途的组织工程心肌或血管研究的种子细胞来源。
干细胞组织工程研究已经成功应用于临床。随着干细胞研究的深入，将会在先心病外科重建中发挥重要的作用。
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先天性心脏病(先心病)如法洛四联症和伴有肺动脉狭窄的右室双出口、大动脉转位以及永存动脉干、单心室等，一般都需要通过补片或外管道重建右室流出道。人工合成材料如聚四氟乙烯和经过处理的牛心包修补后，由于这类材料没有生长能力，对于人体是异物，容易出现感染和血栓形成，远期可能因出现梗阻或堵塞而需要二次手术[1]。同种生物补片和自体心包具有良好的生物相容性，无血栓形成，具有抗感染性能；但它们存在内层蛋白沉着、钙化，可能出现皱缩或扩张，而且这类补片没有收缩能力，无法辅助右室泵功能[2]。而通过组织工程方法构建组织工程血管或心肌补片可以克服上述补片的缺点，达到理想的先心病外科重建的目的。近年来，研究者对干细胞的研究进一步加深，将干细胞与组织工程结合起来，在体外构建组织工程血管或心肌补片是一个非常活跃且很有应用前景的研究领域[3,4]。本文就干细胞组织工程体外构建组织工程血管或心肌补片应用于先心病重建的研究现状作一综述。
干细胞是一类具有自我复制能力及多向分化潜能的未分化或低分化细胞。能够通过不对称分裂进行自我更新，在一定的条件下，能够分化为具有一定功能的细胞群。干细胞根据发育潜能分为全能干细胞、多能干细胞(pluripotent stem cells, PSCs)和单能干细胞。根据所处的发育阶段分为胚胎干细胞(embryonic stem cells, ESCs)和成体干细胞。诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)最初是日本科学家Yamanaka等[5,6]采用体外基因转染技术，将成纤维细胞重编码为iPSCs。iPSCs在细胞形态、基因和蛋白表达、表观遗传修饰状态、细胞倍增能力、分化能力等方面都与ESCs相似，又是一种完全不同于ESCs和成体干细胞的新的细胞类型。
成体干细胞是干细胞的一大亚群，这些细胞可以自体来源、不存在组织配型及免疫排斥的问题，同时取材分离方便、体外扩增能力强。成体干细胞存在于骨髓、外周血、脐带、脂肪及一些实体组织中，其中以骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)研究最受瞩目，是心血管组织工程研究理想的细胞来源[7]。除了骨髓，脂肪和脐带组织也是丰富的MSCs来源，这些细胞类似于骨髓MSCs。研究发现，脐带干细胞能够分化为心肌细胞，促进心肌再生，同时这些细胞能够分化为内皮细胞，促进血管新生[8,9]。脐带干细胞分离方便，对婴儿和母亲没有影响，可以冻存以便将来使用，使脐带干细胞成为非常有前景的组织工程种子细胞来源。目前，我国已经成功建立起各种脐血及脐带干细胞库。
组织工程的构建方法主要是通过细胞－支架法，即将支架材料制成一定的形状，将种子细胞接种到支架上；在一定的条件下，种子细胞和支架材料混合生长构建出能够外科裁剪，有一定韧性，能够体内移植修复心脏缺损或重建心脏结构的组织工程血管或心肌补片[16]。Caspi等[17]以ESCs为种子细胞，在体外成功构建出具有血管结构的组织工程心肌。有研究将ESCs分化来的心肌细胞种植在含Matrigel的Ⅰ型液态胶原上，7 d后构建组织工程心肌块发生协调一致的收缩，并对物理或药物刺激发生反应；进一步研究发现，构建的心肌块在结构和功能上都初步具备了新生儿心肌组织的特点[18]。Wu等[19]通过细胞片法，借助于一种温敏材料，获得单层细胞片，将单细胞片层叠加混合继续培养获得具有3D结构的心肌样组织。但细胞片法构建的心肌补片不够坚韧，不能外科裁剪，所以目前主要用于心肌梗死的修复研究。
组织工程中支架材料起到细胞外基质作用，是细胞附着的基本框架和代谢场所，如何促进细胞在支架材料上的黏附、生长及控制支架材料的降解与细胞生长、组织形成相一致也是一个非常有意思的课题。目前，对细胞与支架材料之间的信号通路包括整合素、细胞因子及激素之间的关系和相互影响还知之甚少[20]。近年来，研究者们通过模拟体内组织生长所处的动力微环境，构建各种不同类型的培养系统，已设计出了多种提供动力环境的培养系统，如机械搅拌式反应器[21]、灌注培养反应器[22]、模拟微重力旋转生物反应器[23]等，可为体外心肌细胞的生长提供较为理想的环境。对于体外构建3D组织工程移植物，还存在再血管化的问题。最近的研究结果表明，通过添加促进血管生成的因子比如血管内皮生长因子、胰岛素样生长因子等，能够促进血管的生成，有助于移植物的存活和体外生长[24]。这方面的研究将对最终研制出临床可用的组织工程血管或心肌组织起到至关重要的作用。
目前，在先心病心脏缺损修复或重建中存在的一个突出问题就是缺乏具有生长潜能的组织替代物，利用自体干细胞构建有活性的组织工程血管或心肌补片将有望解决这一难题。Matsumura等[25]将骨髓干细胞种植到支架材料上，体外构建组织工程血管补片，并将构建的血管补片移植到狗的下腔静脉处，没有出现血管狭窄、血栓形成等并发症。Mettler等[26]提取羊的内皮细胞和骨髓MSCs，种植到支架材料上，构建组织工程血管补片并移植到右室流出道至肺动脉部位，术后未出现狭窄、血栓形成或动脉瘤等并发症，心脏超声显示流出道通畅，无跨瓣压差。Gottlieb等[27]成功采用骨髓MSCs和可降解支架材料构建组织工程带瓣管道并将构建的自体带瓣管道移植到羊的肺动脉瓣部位，重建右室流出道；术后6周心脏超声提示最大跨瓣压差为17 mmHg(1 mmHg＝0.133 kPa)，肺动脉瓣基本为微量反流，但随着时间的延长，反流渐加重；MRI发现组织工程带瓣管道没有出现皱缩、扩张、钙化等并发症；组织学检查发现随着支架材料的降解，干细胞在瓣膜支架上的分布和表型与自体瓣膜非常相似。
Mihic等[28]采用ESCs分化来的心肌细胞种植到塑型的明胶支架上，在动力反应器中培养，并将培养的组织工程心肌移植到大鼠心肌梗死部位，发现构建的组织工程心肌组织更加坚韧、心肌细胞的附着率和成熟度更高，移植后具有更高的细胞存活率和迁移分化能力。Kawamura等[29]以iPSCs分化来的心肌细胞为种子细胞，采用细胞片法体外构建心肌补片，移植到猪的心肌梗死部位能够促进梗死心肌的恢复。这些研究结果显示，在外科治疗之前，提取患者的干细胞，体外构建组织工程血管补片或带瓣管道，将具有非常诱人的前景。
在动物实验研究的基础上，Shin'oka等[30]进一步将骨髓干细胞构建的组织工程血管应用到临床先天性心脏缺损修复重建中，入选的患儿在术前抽取骨髓，分离骨髓干细胞并将其种植在可降解的支架材料上，构建组织工程血管；共有42名患儿接受了组织工程血管的移植重建手术，其中23例为功能性单心室需行心外管道全腔静脉肺动脉连接术的患儿，19例为先天性心脏缺损修补；随访过程中，所有患儿没有出现补片相关的血栓形成、狭窄及阻塞等并发症。最近，Hibino等[31]报道了25例患儿采用骨髓干细胞构建的组织工程血管作为心外管道行全腔静脉肺动脉连接术治疗的长期随访结果：平均随访时间为5.8年，没有出现组织工程血管相关的术后死亡、血管破裂、感染等并发症，1例患儿出现附壁血栓，经服用华法林治愈；4例出现了血管管腔狭窄，采用经皮血管成形术治愈；血管造影没有发现瘤状突出和钙化，随时间的推移，血管内径增加，具有生长潜能，但管腔狭窄的原因需要进一步的随访和研究。这些令人鼓舞的研究结果显示，组织工程血管或心肌补片将会在先天性心脏病的外科治疗领域发挥重要的作用，成为临床重建材料的重要补充，并将会进一步取代这些材料，从而提高先天性心脏病外科治疗的整体水平和远期结果。
iPSCs和ESCs在体外可以分化为自发跳动的具有生理功能的心肌细胞[14]，同时，iPSCs能够分化为具有功能的内皮细胞，为组织工程血管内皮化或组织工程心肌血管再生提供了理论支持[32]。出于安全性考虑，目前尚没有利用iPSCs和ESCs构建组织工程心肌或血管应用于临床的报道，但相信在不远的将来，这些细胞将会在细胞治疗及组织工程研究领域发挥很大的作用。
综上所述，干细胞组织工程研究在动物实验中取得良好的结果，并已成功应用于临床。随着干细胞研究的深入，采用自体干细胞构建心血管移植物具有光明的前景，将会在先天性心脏病外科重建中发挥重要的作用。虽然干细胞研究取得了很大进展，但是，目前还没有完善的干细胞分离、诱导和纯化方案，分化的具体机制还未完全阐明，特别是在诱导分化过程中如何分选出需要的种子细胞也是有待解决的难题。今后进一步的研究方向包括：寻找合适的支架材料，最佳的细胞来源、种植方法以及体外构建的条件，生物反应器的应用，各种细胞活性因子的释放和控制，移植物再血管化等。相信在不久的将来，随着上述问题的解决，最终能够构建出具有生物活性、能够外科裁剪使用的组织工程补片材料。
