研制复合重组人骨形态发生蛋白2(rhBMP-2)壳聚糖水凝胶的新型HA/ZrO2多孔泡沫陶瓷人工椎体，并观察其修复beagle犬椎体骨缺损的能力。
离子交联法制备壳聚糖水凝胶作为rhBMP-2的缓释载体，扫描电镜下观察其微观形态，检测其载药量、包封率及缓释速率。将HA/ZrO2多孔泡沫陶瓷人工椎体复合rhBMP-2壳聚糖水凝胶，构建新型HA/ZrO2多孔泡沫陶瓷人工椎体。将12只beagle犬按数字表法随机分为3组，每组4只；均采用手术造成半径9 mm、高23 mm的半圆柱状L4椎骨缺损模型，其中A组植入复合rhBMP-2壳聚糖水凝胶的新型HA/ZrO2多孔泡沫陶瓷人工椎体，B组植入复合空白干燥壳聚糖的新型HA/ZrO2多孔泡沫陶瓷人工椎体，C组植入实验犬自体髂骨。术后6、12、24周对实验犬行大体观察、X线影像学观察；术后24周取实验犬椎体标本行离体Micro CT新生骨量检测及生物力学检测。
制备所得壳聚糖水凝胶扫描电镜下呈3D网状结构，内部均匀分布壳聚糖微球，其负载rhBMP-2后包封率达91.88%±1.53%，载药量为(39.84±2.34)ng/mg；释放率第1天为28.32%±3.01%，第3天为48.92%±6.27%，第12天为74.40%±6.29%。术后6周C组动物平均活动度恢复较A组和B组快(P值均<0.05)，A、B组差异无统计学意义(P>0.05)；术后12、24周B组与C组活动度比较差异均有统计学意义(P值均<0.05)，A、C组差异均无统计学意义(P值均>0.05)。术后6、12、24周X线影像学观察显示，A组椎体置换术后骨痂生成逐渐增多，植入材料与宿主骨之间的界线逐渐模糊，至24周时人工椎体周围新生骨与自体骨融为一体；C组在24周时出现明显非承重部位的骨吸收，出现较快的自体骨塑形；B组椎体置换术后人工椎体与自体骨的融合速度慢于A组和C组。术后24周标本Micro CT新生骨量检测结果显示，A组(145.38±18.52)mm3，B组(86.30±15.60)mm3，两组比较差异有统计学意义(t＝4.879, P<0.01)。术后24周A、B、C组手术节段椎体标本抗压强度分别为(14.03±1.67) MPa、(8.62±1.24) MPa、(13.79±1.43) MPa，A组和C组椎体极限抗压强度均高于B组(P值均<0.01)，而A组与C组比较差异无统计学意义(P>0.05)。
复合rhBMP-2壳聚糖水凝胶新型HA/ZrO2多孔泡沫陶瓷人工椎体能有效修复脊柱骨缺损，有望代替自体髂骨移植运用于临床骨缺损的修复。
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目前，临床上通过移植人工骨的方法治疗骨缺损已经变得十分普遍，其成功的关键在于人工骨能诱导正常新生骨长入并使之融为一体[1]。而如何提高人工骨组织材料的成骨性能和骨融合率成为骨组织工程研究的热点[2,3,4,5]。重组人骨形态发生蛋白2(recombinant human bone morphogenetic protein-2, rhBMP-2)是公认的骨诱导因子，是唯一能诱导多能造血干细胞和间充质干细胞中所有成骨细胞分化的形态发生蛋白。但其临床应用也存在许多问题和不足[6,7]：首先，纯化的骨形态发生蛋白半衰期短，植入体内后与体液和酶类接触很快被扩散并水解[8]；其次，一次性过量使用rhBMP-2又带来许多副作用，如植入物周围早期的骨溶解，继发植入物松动 [9,10]、椎管内异位骨化[11]等。故寻找能够承载并缓释rhBMP-2的方法，使局部可长时间维持稳定有效的rhBMP-2浓度具有重要的理论和实际应用价值[12,13]。壳聚糖是一种具有良好生物相容性及生物可降解性的无毒天然材料，其带正电荷和-NH2基团的特性，使其可与带负电荷的聚合物，大分子蛋白相互作用，近来被广泛应用于生物制药及药物缓释领域[14,15]。本课题采用ZrO2作为HA的增强体制备HA/ZrO2多孔泡沫陶瓷人工椎体，并将其复合rhBMP-2壳聚糖水凝胶，以期制备具有良好生物相容性、骨诱导性和高力学强度的新型HA/ZrO2多孔泡沫陶瓷人工椎体，为临床脊柱骨缺损的治疗奠定实验基础。
beagle犬12只，雄性，月龄5～6个月，体质量10.3～12.5 kg，清洁级，由浙江中医药大学实验动物中心提供[生产许可证号：SCXK(浙)2010-0043]，普通环境饲养。实验人员在整个实验过程中都遵循实验动物保护条例。壳聚糖(脱乙酰度﹥90%，Sigma，美国)；三聚磷酸钠(Sigma，美国)；rhBMP-2(Sigma，美国)；ELISA试剂盒(R&D，美国)；冷冻干燥仪(Labconco，美国)；酶联免疫测试仪(Thermo Scientific Varioskan Flash，)；Micro CT(SKYSCAN BRUKER，比利时)；扫描电镜(S-3000N HITACHI，日本)；真空离子溅射仪(HITACHI E-1010，日本)；万能材料实验机(INSTRON 5569，美国)。
参照文献[14]中的制作方法并加以改进，将一定质量壳聚糖溶解于0.3%醋酸溶液中，搅拌至完全溶解，配置成1.5 mg/mL壳聚糖溶液；将一定质量三聚磷酸钠溶于超纯水中，配置成0.5 mg/mL三聚磷酸钠溶液。取壳聚糖溶液100 mL，以壳聚糖与三聚磷酸钠总质量比为5∶1量取对应所需三聚磷酸钠溶液，两种溶液依次用0.45 μm、0.22 μm滤膜过滤。在持续磁力搅拌下，用7号注射器吸取三聚磷酸钠溶液缓慢滴加到壳聚糖溶液中，滴速控制在30滴/min。反应完全后可见溶液由无色变为淡蓝色，继续搅拌1 h，用0.5% NaOH溶液调节pH值至7.2～7.4。将交联所得溶液分装至培养皿，冷冻干燥。
将冻干壳聚糖凝胶裁剪成3 mm×1 mm的小片，用导电胶固定于样品台上，真空离子溅射仪表面溅射喷金，扫描电镜观察干燥壳聚糖水凝胶表面3D结构，并选择合适倍数拍摄扫描照片。
本实验采用先制备出空白干燥壳聚糖，再利用壳聚糖的吸水溶胀作用负载rhBMP-2，故采用ELISA法测定壳聚糖负载rhBMP-2凝胶化后管底残留的rhBMP-2量来计算壳聚糖水凝胶的载药量和包封率。
载药率＝[(投入rhBMP-2总量－管壁残留rhBMP-2总量)/干燥壳聚糖总质量]×100%
包封率＝[(投入rhBMP-2总量－管壁残留rhBMP-2总量)/投入rhBMP-2总量]×100%
取5 mL试管5支，每支试管中置入干燥壳聚糖40 mg，向每管干燥壳聚糖中滴加20 μg/mL rhBMP-2 100 μL，置于37 ℃恒温箱中凝胶化。待复合rhBMP-2壳聚糖水凝胶变为淡黄色凝胶状后，向每支试管中加入2 mL含0.1%牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)的磷酸盐缓冲液(phospate buffer solution, PBS)(pH 7.4)，置于37 ℃恒温箱。取每支试管不同时间点(0.5、1、2和3 d，以后每隔3 d 1次，至第15天)上清液100 μL，采用ELISA法检测上清液rhBMP-2浓度，后补充相应量含0.1% BSA的PBS液。根据ELISA标准曲线计算采样rhBMP-2含量并绘制累计释放曲线。
rhBMP-2累计释放率＝[(上清液rhBMP-2浓度×2 mL)/ 2 μg] ×100%
(1)新型HA/ZrO2泡沫陶瓷人工椎体制备：由本课题合作单位上海大学材料学院，尺寸按实验犬椎体参数设定。半径9 mm、高23 mm，见图1。(2)复合空白干燥壳聚糖人工椎体的制备：将采用上述方法交联所得壳聚糖溶液分装至培养皿。将HA/ZrO2泡沫陶瓷人工椎体浸入交联完全的壳聚糖溶液中，冷冻干燥。取出冻干后空隙中负载干燥壳聚糖的HA/ZrO2泡沫陶瓷人工椎体，环氧乙烷消毒备用。(3)复合rhBMP-2壳聚糖水凝胶的新型HA/ZrO2多孔泡沫陶瓷人工椎体的制备：在术中临时制备。术中安放人工椎体前30 min，取出消毒好的负载有交联后空白干燥壳聚糖的HA/ZrO2泡沫陶瓷人工椎体，将20 μg/mL rhBMP-2溶解液500 μL均匀滴加至1个人工椎体上，使500 μL rhBMP-2溶解液完全被干燥壳聚糖吸附。故每个椎体共负载rhBMP-2 10 μg。
将12只实验犬按数字表法随机分为3组，每组4只。A组：植入复合rhBMP-2壳聚糖水凝胶的新型HA/ZrO2多孔泡沫陶瓷人工椎体；B组：植入复合空白干燥壳聚糖的新型HA/ZrO2多孔泡沫陶瓷人工椎体；C组：植入实验犬自体髂骨。所有骨缺损造模、血管结扎、材料放置与钢板固定均由同一组实验人员完成。手术采用3%戊巴比妥钠按1 mL/kg剂量经静脉注射麻醉。实验犬取右侧卧位，手术取腰椎前外侧入路，切口长约12 cm，依次切开腰背部皮肤、皮下组织，触摸实验犬最下肋及腰椎横突定位。在L4椎体水平自腰大肌肌间隙钝性分离肌肉，充分游离L4椎体水平双侧腰横动脉及伴行静脉并予以结扎。盐水纱布保护并牵开腹主动脉、下腔静脉，充分暴露L4椎体及上下相邻半个椎体。在冠状面以横突为界平行凿除L4椎体的前2/3，以不可超越横突为限，以免凿入椎管，手术造成约半径9 mm、高23 mm半圆柱形骨缺损。A、B、C组按实验设计植入不同的内置物。确认各组内置物无松动后，再以长度50 mm手外科钢板偏侧面固定上下2椎体，钢板两端各上1枚螺钉固定。术后常规喂养，不作其他外固定。术后每只动物予以青霉素160万U肌内注射，每日1次，持续3 d。
术后即刻观察实验犬站立情况，分别在术后6、12、24周行活动度检测。活动度检测方法为记录相同食物、相同高度诱惑下实验犬每分钟跳跃次数，每只实验犬每隔0.5 h重复1次，共计3次。分别与术后6、12、24周，在静脉麻醉下，摄腰椎侧位X线片，观察植入泡沫陶瓷人工椎体周围骨痂生长情况及置换节段椎体高度变化。术后24周，在3%戊巴比妥钠(1 mL/kg)静脉麻醉下，采用空气栓塞法处死各组动物；暴露手术节段，相邻椎体从椎间盘处离断，取手术节段实验犬腰椎椎体；剔除腰椎椎体周围软组织，保留椎体小关节突完整，－20 ℃冰箱冷冻保存。
Micro CT 180°平扫取A组、B组术后24周离体实验犬椎体标本，定位全部材料区域为感兴趣区(region of interest, ROI)；以50 μm作为横切面层厚，对材料区域行横切面扫描，采用Micro CT信号选择功能抑制材料本身超高信号区域，产生约200张新生骨2D图像。利用Micro CT计算全部材料区域的新生骨量(bone volume, BV)。选取靠近材料上表面5张2D图像(共250 μm厚度)，利用Micro CT自带分析软件进行新生骨3D重建。
生物力学测试是检验生物材料修复骨缺损有效性的金标准，极限抗压实验是脊柱生物力学常用的方法。本试验利用极限抗压实验测量泡沫陶瓷人工椎体和实验犬自体骨融合后整个椎体的抗压强度。具体方法：取出－20 ℃冰箱冷冻椎体标本置于常温下解冻24 h。采用游标卡尺测量每个椎体表面的平均长度和宽度，计算每个材料受力界面表面积计为S(m2)。再将椎体标本上下端牢固固定，保证材料中心力线不倾斜。试验机加载速率为0.5 mm/min，载荷从零开始一直压缩至椎体屈服为止，计算机辅助设计自动记录仪记录载荷－位移曲线。实验在结构模拟、加载速度、安装固定方法等条件上均保持一致，以提高检测精确度。根据载荷－位移曲线读取最大抗压力Fm(N)。极限抗压强度计算公式：
P(Pa)＝Fm(N)/S(m2)
Fm(N)为最大载荷，S(m2)为受力表面积。
采用SPSS 17.0软件对研究数据进行统计学分析。术后活动度检测及极限抗压强度检测采用单因素方差分析及SNK-q检验；新生骨量检测采用独立样本t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
扫描电镜下冻干壳聚糖呈3D网状薄膜结构，3D孔径50～300 μm，膜状结构表面均匀分布有直径微米级壳聚糖微球，微球圆形径粒均一，表面光滑无皱，见图2。
经测定制备所得壳聚糖水凝胶复合rhBMP-2的包封率为91.88%±1.53%(n＝3)；载药量为(39.84±2.34) ng/mg(n＝3)。
rhBMP-2累积释放量以游离rhBMP-2含量占负载总量的百分比表示。rhBMP-2的释放表现出阶段性释放规律：在前3天中rhBMP-2表现为爆发性释放阶段，第1天时释放率为28.32%±3.01%，第3天时释放率达48.92%±6.27%，之后逐渐进入rhBMP-2缓慢释放阶段(第3～12天)，到第12天时累积释放率达74.40%±6.29%，最后进入稳定阶段(第12～15天)，到第15天时rhBMP-2累积释放率为76.97%±6.05%，最后3天释放率仅增加2.57%。见图3。
实验犬术毕均能自主站立；术后所有实验动物未出现伤口感染、化脓现象。术后6、12、24周活动度检测显示，术后6周C组动物平均活动度恢复较A组和B组快(P<0.05)，A、B组差异无统计学意义(P>0.05)；术后12、24周B组与C组活动度比较差异均有统计学意义(P值均<0.05)，但A、C组差异均无统计学意义(P值均>0.05)。见表1。取材时观察植入材料周围组织的反应及泡沫陶瓷内部新生骨形成情况，可见术后24周A组与B组人工椎体均与周围自体骨融合良好，材料内部有明显新生骨形成；C组自体髂骨与椎体已融为一体，无明显界限。
3组实验犬术前及术后6、12、24周活动度的比较(次/min, 
±s)
3组实验犬术前及术后6、12、24周活动度的比较(次/min, ±s)
| 组别 | 例数 | 术前 | 术后6周 | 术后12周 | 术后24周 |
|---|---|---|---|---|---|
| A | 4 | 19.67±6.56 | 4.17±1.80 | 12.25±4.03 | 15.25±4.43 |
| B | 4 | 22.33±3.98 | 3.92±1.78 | 9.42±3.12 | 12.25±3.89 |
| C | 4 | 21.25±5.24 | 7.42±1.93ab | 13.67±4.27b | 18.25±5.48b |
| F值 | － | 0.753 | 13.538 | 3.816 | 5.002 |
| P值 | － | >0.05 | <0.01 | <0.05 | <0.01 |
注：A:复合rhBMP-2壳聚糖水凝胶人工椎体组；B: 复合空白壳聚糖水凝胶人工椎体组；C: 自体髂骨组；SNK-q检验：与A组比较aP<0.05，与B组比较bP<0.05
各组实验犬术后6、12、24周腰椎X线检查见图4。与术后6周比较，术后24周A组复合rhBMP-2壳聚糖水凝胶人工椎体周围有明显新生骨形成，表现为人工椎体内部密度逐渐增强，人工椎体与自体骨间隙逐渐减小，且腰椎正常生理曲度逐渐恢复，手术节段椎体高度无明显丢失；B组复合空白壳聚糖水凝胶人工椎体周围亦有新生骨形成，人工椎体与自体骨间隙有所减小，椎体高度亦无明显改变，但术后24周实验犬腰椎正常生理曲度恢复较A组和C组缓慢；C组自体髂骨术后24周腰椎后突畸形基本消失，上下椎体间有少量骨桥形成，且在不承重区域出现明显骨吸收，说明自体髂骨塑形快于A组和B组。
术后24周Micro CT ROI新生骨量检测结果显示，A组(n＝4)材料内部新生骨量为(145.38±18.52)mm3，B组(n＝4)为(86.30±15.60)mm3，差异有统计学意义(t＝4.879, P<0.01)。采用Micro CT信号选择功能抑制材料本身超高信号后对2组材料上表面250 μm范围行Micro CT新生骨3D重建，结果见图5。
单纯HA/ZrO2泡沫陶瓷人工椎体体外的极限抗压强度为(2.24±0.36) MPa。植入术后24周，A、B、C组椎体标本的极限抗压强度分别为(14.03±1.67) MPa、(8.62±1.24)MPa、(13.79±1.43)MPa，差异具有统计学意义(n均为4，F＝17.596，P<0.01)。其中A组、C组抗压强度高于B组，差异均有统计学意义(P值均<0.01)；A、C组比较差异无统计学意义(P>0.05)。
壳聚糖具有一定的止血、抗菌、抗癌转移等作用[16]。由于rhBMP-2极易失活，为保证载药水凝胶中rhBMP-2活性，本实验采用单纯三聚磷酸钠作为交联剂，先制备出空白干燥壳聚糖，再利用壳聚糖水凝胶的吸水溶胀作用将rhBMP-2载入的方法，明显缩短了rhBMP-2在外界环境中的暴露时间，最大限度地保证了药物活性。
从rhBMP-2体外累积释放曲线可以看出，rhBMP-2的释放表现出阶段性规律，在前3天时为爆发性释放阶段，之后逐渐进入缓慢释放阶段(3～12 d)，最后进入稳定阶段(13～15 d)。这主要取决于rhBMP-2从壳聚糖水凝胶中缓释的机制。rhBMP-2从壳聚糖水凝胶中释放的机制包括：(1)通过静电、表面吸附等物理包埋方式所结合的rhBMP-2从水凝胶表面释放，特征为暴发性释放，称为扩散缓释；(2)通过与特殊化学基团形成共价键作用所结合的rhBMP-2，这部分rhBMP-2伴随着壳聚糖的降解从水凝胶内部游离出来，特征为缓慢释放，称为降解缓释。15 d后进入稳定阶段，即药物基本释放完全，但此时rhBMP-2含量也仅占滴加总量的76.97%，这可能是由于rhBMP-2在溶解和缓释取样过程中的损耗、失活等原因造成。本实验所制备的壳聚糖水凝胶具有良好的表面形态，制备流程安全、简单，并能起到很好的缓释作用。
另外，理想的人工骨材料需要具有良好的生物相容性和足够的力学强度。人工骨材料植入人体后会在机体内长期存留，故良好的生物相容性是材料安全性的保障。HA/ZrO2梯度复合材料是一种无细胞毒性、无急性体内毒性、不致溶血性，具有良好组织相容性的生物材料[17,18,19]；通过材料的浸提液培养新提取的健康年轻人末梢血单个核细胞，包括对其凋亡、CD3/CD69的表达、淋巴细胞的转化和细胞因子变化的检测，表明HA/ZrO2生物陶瓷材料具有良好的生物相容性[20]。本研究将HA/ZrO2复合材料制成人工椎体植入实验犬椎体后发现，实验动物术后活动度、饮食等大体情况良好，伤口及手术深部未出现感染等表现，实验犬术后也未出现体温升高等免疫排斥反应。证明HA/ZrO2复合材料人工椎体植入后不引起机体周围组织的不良反应，具有良好的体内生物相容性。
此外在促使骨融合方面，HA良好的骨传导性和骨诱导性已经得到了充分的验证，是广泛应用于基础及临床研究的骨替代材料[21]。HA部分降解后可释放出大量Ca2＋和HPO42-离子沉积于陶瓷基体表面。骨缺损的修复，主要在于诱导新生骨形成，而新生骨形成不管膜内成骨或软骨内化骨，都需要经过新生骨的矿化过程。而新生骨的矿化实质上是体液中的钙、磷离子沉积形成磷灰石的过程。故要使新生骨快速矿化需要使局部钙、磷离子浓度升高至临界值，从而刺激新骨的生成；本研究将HA/ZrO2复合材料制成多孔泡沫陶瓷人工椎体后，材料表层HA与新生骨接触面积增加，也可明显提高植入材料与自体骨结合的强度[21,22]。最后，将HA/ZrO2复合材料人工椎体制备成多孔状泡沫陶瓷后可同样保证其具备足够的力学强度，可满足术后即时稳定性。本研究制备的泡沫陶瓷人工椎体体外具有2.31～3.10 MPa的抗压强度，植入动物体内24周后极限抗压强度可达(8.62±1.24)MPa，而复合rhBMP-2壳聚糖水凝胶后的人工椎体植入体内24周后极限抗压强度可达(14.03±1.67)MPa，接近自体髂骨移植后椎体的极限抗压强度。术后24周CT 3D重建及新生骨量检测也显示人工椎体空洞内有大量的新生骨形成，表明HA/ZrO2梯度复合泡沫陶瓷材料人工椎体可起到良好的修复椎体缺损的作用，而将其复合rhBMP-2壳聚糖水凝胶后可进一步提升人工椎体的体内成骨诱导能力。
本研究从动物体内实验方面充分证实复合rhBMP-2壳聚糖水凝胶人工椎体具备良好的椎体骨缺损修复能力，但其细胞水平的骨诱导机制尚未完全阐明，有待进一步研究。
