定量研究兔激素性股骨头坏死模型(SANFH)MR横向弛豫时间在造模不同时相的变化规律，探讨所反映的骨髓组分及微结构变化。
健康成年纯种新西兰大白兔60只，采用随机区组抽样方法分为空白对照(8只)及造模2、4、6、8周组(各13只)。制作模具小管并行MR T2 mapping序列MR扫描，评价所得参数即T2值的稳定性。参照Yamamoto的方法对模型组进行造模处理。造模开始前对空白对照组进行MR扫描，各模型组分别在造模后满2、4、6、8周时行MR扫描，将横向弛豫原始图像数据传至GE AW4.2工作站进行后处理，计算各像素T2、T2*值，创建相应参数的彩色编码图，对股骨头区、骺下区及髓腔骺端进行测量域感兴趣区的特征参数值；扫描完成后将实验动物处死，切取股骨头进行组织形态学检查。
剔除实验期间死亡动物及无效图像资料，MR检查并获得有效数据的空白对照及造模2、4、6、8周组实际样本量分别为8只(16髋)、10只(20髋)、9只(18髋)、9只(18髋)、10只(20髋)。各模型组及空白对照组T2值(F＝51.601, P<0.01)、T2*值(F＝36.889, P<0.01)组间总体差异有统计学意义。造模各组T2、T2*值均低于空白对照组，造模早期(2周)出现明显下降，4周降至最低，6、8周出现部分恢复；各解剖区域间T2(F＝86.274, P<0.01)、T2*(F＝53.172, P<0.01)值差异有统计学意义；股骨头区T2、T2*值高于骺下区及髓腔骺端，骺下区高于髓腔骺端(P值均<0.05)。组织形态学变化：造模早期表现为骨髓造血细胞减少及脂肪细胞增生，髓内微血管血栓及出血，4周最为显著，之后出现骨组织坏死，骨小梁变细、部分消失，间质反应(充血、水肿、出血)及纤维化。
MR横向弛豫时间可敏感地反映SANFH模型骨髓组分及骨小梁微结构特征性改变，为此病早期诊断及病程监控提供了重要的定量影像学方法。
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激素性股骨头缺血性坏死(steroid-induced avascular necrosis of the femoral head, SANFH)是一种临床常见的难治性疾病，常规MRI技术被认为是目前早期诊断最敏感影像学方法[1,2]。但基于SANFH复杂的病理变化过程，MRI信号强度的测定受到诸多因素影响，难以进行准确的量化评价。常规MRI检查虽具有早期诊断敏感性的优势，但在诊断的特异性、病程监控及疗效评价的应用上具有一定的局限性。本研究采用MR横向弛豫时间测定技术，对激素诱导造模后不同时相动物模型骨质横向弛豫时间进行测定，研究骨髓组分及微结构的变化，为SANFH提供无创、敏感、定量的影像学检查方法。
健康成年纯种新西兰大白兔60只，20～26周龄，雌雄不限，体质量2.5～3.5 kg，由首都医科大学动物实验室提供，合格证编号：SCXK(京)2005-0009。所有动物标准条件下单笼饲养，自由饮水，通风，普通条形饲料喂养。
采用随机区组抽样方法将不同体质量的实验动物分为5组，其中空白对照组(N组)8只，模型2周组(M2W组)13只，模型4周组(M4W组)13只，模型6周组(M6W组)13只，模型8周组(M8W组)13只。模型组均为造模成功后计时。
参照Yamamoto[3]使用激素加内毒素诱导兔实验性股骨头坏死模型的方法：兔耳缘静脉注射50 μg/kg肠杆菌内毒素；24 h后进行第2次注射，同时臀肌注射甲基强的松龙20 mg/kg；以后每间隔24 h注射甲基强的松龙1次，共注射3次，完成造模。实验开始前3 d各组动物肌内注射青霉素40万u/d，实验开始后每周注射2次。
取直径0.5 cm，长3 cm的塑料试管3支，分别将0.123、0.246、0.492 mol/L MnCl2溶液沿塑料试管内壁缓缓注入其中，排除空气，加胶塞密闭，制成模具小管，并按上述浓度梯度固定于固定带中。在进行每组实验动物横向驰豫前，对模具小管进行一次扫描，根据原始数据计算各像素T2值，并进行彩色编码，创建相应参数的彩色编码图(图1)，测量模具小管在5个不同的时间点T2值，并计算其平均值、标准差及变异系数(coefficient of variation, CV)，评价所得参数的稳定性。
(1)检查时间：造模开始前对空白对照组进行MR扫描，各模型组分别在造模后满2、4、6、8周时行MR扫描。(2)动物固定及麻醉：按40 mg/kg腹腔注射30%戊巴比妥钠进行麻醉后，实验动物采用仰卧位固定于MR专用固定器上。(3)仪器及扫描：采用GE 1.5T MR扫描仪(Signa EXICITE HD, GE Healthcare, U．S.)。使用8通道相控阵头线圈，在三轴定位像上以股骨头为中心进行扫描。T2 mapping采用多回波自旋回波序列，回波数为4，TE分别为20、40、60、80 ms，TR 2 000 ms，FOV 160 mm，层厚2.0 mm，间隔0 mm，采集矩阵160×160，激励次数1 NEX。T2*mapping采用多回波梯度回波序列，回波数为6，TR 150 ms，偏转角度30，FOV 160 mm，层厚2.0 mm，间隔0 mm，采集矩阵160×160，激励次数4 NEX。(4)影像后处理及参数获取：将扫描所得原始图像数据传至GE AW 4.2工作站，采用Functool软件包进行原始图像数据的后处理。采用R2图像处理软件，根据原始图像数据计算各像素本征横向驰豫时间(T2值)、准横向弛豫时间(T2*值)，并进行彩色编码，创建相应参数的彩色编码图。配合结构图的定位功能，在功能图上选定股骨头关节面下、骺下区及髓腔骺端3个感兴趣区进行测量(图2)。
各组实验动物完成MR扫描后经兔耳缘静脉空气栓塞处死实验动物，手术切取双侧股骨近段。将所取标本在FineFIX固定剂中固定24 h，流水冲洗1 h，置入50%甲酸脱钙液中脱钙48～72 h，流水冲洗10 min，兔股骨头冠状切面取材(厚度为3～5 mm)；取材标本流水冲洗12 h，脱水，石蜡包埋。采用Laica 2155组织石蜡切片机制成厚度为3～5 μm石蜡切片，HE染色。光镜下观察骨髓造血细胞、脂肪细胞的变化，股骨头骨皮质及骨松质中骨坏死、新生骨及间质反应情况。
应用SPSS 13.0软件对数据进行统计学分析。其中所获取各组实验动物的MR横向弛豫参数均服从正态分布，采用
±s表示；不同时相实验组与N组不同解剖部位的T2、T2*值的比较采用随机区组设计的方差分析和SNK-q检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。
2周内实验动物死亡率为19.2%(10/52)，造模过程中总死亡率21.2%(11/52)。麻醉意外死亡2只。M4W组1只实验动物因运动伪影严重影响图像质量而被剔除，MR检查实际样本量为N组8只(16髋)，M2w组10只(20髋)，M4W组9只(18髋)，M6W组9只(18髋)，M8W组10只(20髋)。
实验共进行5次模具扫描，不同浓度MnCl2溶液T2值的CV为4%～6%，系统对T2值的测定较为稳定，所得结果可靠(表1)。
不同浓度MnCl2溶液5次扫描的T2值及变异系数
不同浓度MnCl2溶液5次扫描的T2值及变异系数
| MnCl2溶液(mmol/L) | T2值(ms) | CV(%) | |
|---|---|---|---|
| 均数 | 标准差 | ||
| 0.492 | 37.494 | 1.713 | 4.60 |
| 0.246 | 65.566 | 3.070 | 4.55 |
| 0.123 | 104.917 | 6.382 | 5.84 |
注：CV：变异系数
不同组别实验动物股骨不同解剖区域T2测量结果见表2及图3。造模后各组T2值除M2W组髓腔骺端、M8w组股骨头区及髓腔骺端外，M2W、M4W、M6W、M8W组各解剖区域T2值均明显低于N组，差异均有统计学意义(P值均<0.05)。T2值造模早期(2周)即出现明显下降，4周降至最低，6、8周出现部分恢复。不同解剖区域T2值比较，股骨头区高于骺下区及髓腔骺端，骺下区高于髓腔骺端，差异均有统计学意义(P值均<0.05)。
实验动物股骨各解剖区域T2值组间比较(ms, 
±s)
实验动物股骨各解剖区域T2值组间比较(ms, ±s)
| 组别 | 髋数 | T2值 | ||
|---|---|---|---|---|
| 股骨头区 | 骺下区 | 髓腔骺端 | ||
| N组 | 16 | 93.99±6.25 | 98.95±9.16 | 73.82±6.40 |
| M2w组 | 20 | 77.86±7.61 | 76.15±8.56 | 71.42±7.85 |
| M4W组 | 18 | 72.94±7.72 | 67.19±6.12 | 62.94±5.09 |
| M6W组 | 18 | 84.25±6.44 | 78.50±7.82 | 68.66±5.89 |
| M8W组 | 20 | 91.71±8.49 | 83.62±7.69 | 70.01±4.36 |
| F值 | － | 26.180 | 37.019 | 7.939 |
| P值 | － | <0.01 | <0.01 | <0.01 |
注：N：空白对照；M2W：模型2周；M4W：模型4周；M6W：模型6周组；M8W：模型8周；T2值在不同组间比较，F＝51.601, P<0.01；T2值在不同解剖区域间比较，F＝86.274, P<0.01
不同组别实验动物股骨不同解剖区域T2*值见表3。造模后各组T2*值除M2w组髓腔骺端、M8W组股骨头区及骺下区外，各解剖区域T2*值明显低于N组，差异有统计学意义(P值均<0.05)。造模早期(2周)即出现明显下降，4周降至最低，6、8周出现部分恢复。不同解剖区域T2*值比较，股骨头区高于骺下区及髓腔骺端，骺下区高于髓腔骺端，差异均有显著统计学意义(P值均<0.05)。
实验动物股骨各解剖区域T2*值组间比较(ms, 
±s)
实验动物股骨各解剖区域T2*值组间比较(ms, ±s)
| 组别 | 髋数 | T2*值 | ||
|---|---|---|---|---|
| 股骨头区 | 骺下区 | 髓腔骺端 | ||
| N组 | 16 | 23.80±2.77 | 21.61±1.92 | 19.96±4.10 |
| M2w组 | 20 | 18.73±1.52 | 17.92±1.70 | 19.22±2.31 |
| M4W组 | 18 | 18.04±0.67 | 16.82±2.29 | 14.71±1.58 |
| M6W组 | 18 | 22.10±1.54 | 19.74±2.12 | 16.85±1.07 |
| M8W组 | 20 | 22.95±2.69 | 20.44±2.22 | 17.08±1.48 |
| F值 | － | 30.527 | 15.467 | 14.597 |
| P值 | － | <0.01 | <0.01 | <0.01 |
注：N：空白对照；M2W：模型2周；M4W：模型4周；M6W：模型6周组；M8W：模型8周；T2*值在不同组间比较，F＝36.889, P<0.01；T2*值在不同解剖区域间比较，F＝53.172, P<0.01
造模后股骨组织形态学改变主要累及股骨头、干骺端及大粗隆，镜下可观察到骨皮质、骨松质及骨髓细胞的一系列变化，综合各实验组的组织形态学表现，其镜下主要表现为：骨组织(皮质骨及松质骨)坏死、骨髓细胞(造血细胞及脂肪细胞)变化、间质反应(充血、水肿、出血)及增生性改变。
股骨头区小梁间隙内的骨髓细胞与脂肪细胞比例为2～3∶1，骨小梁规则排列，骨细胞小，细胞核位于中央。骺下区为规则排列的松质骨，其走行几乎垂直骺板，并向下与股骨干髓腔相延续，髓腔内主要由骨髓细胞与散在脂肪细胞组成，两者的比例为2～3∶1。股骨大粗隆内骨小梁相对稀疏，但排列整齐，骨细胞结构清晰，无明显的细胞核浓缩及空骨陷窝，其间以脂肪细胞为主，骨髓细胞与脂肪细胞比例为1∶2～3。见图4。
以骨髓及骨细胞的变化为主，干骺端及股骨头骨小梁间脂肪细胞增生，伴有脂肪细胞的变性及片状坏死，并出现炎性细胞浸润，可见出血、水肿及微小血管血栓现象。骨小梁骨细胞核固缩、浓聚，部分崩解消失，空骨陷窝明显增多。
主要表现为髓腔内及股骨头区出现骨髓坏死，即骨小梁间脂肪细胞明显大片状变性、坏死，脂肪细胞核消失。股骨头骨板下血管内微血栓大量形成，明显骨髓内出血。骨皮质及骨小梁骨基质吸收。见图5。
主要表现为间质反应及骨小梁的明显吸收。脂肪细胞增生，片状或灶性坏死仍然可见，造血细胞明显减少或消失，纤维组织增生，间质炎性细胞浸润，充血、水肿。股骨头区及股骨髓腔骺端骨小梁明显稀疏变细，同时伴有新生骨形成。骨外膜可见骨母细胞增生活跃。见图6。
近年来，大量的临床和实验研究证实骨坏死是激素治疗后的一种严重的并发症，随着糖皮质激素在临床急救、器官移植、免疫系统疾病治疗过程中的广泛应用，SANFH的发生率在非创伤性股骨头坏死中占据首位[4]。SANFH的早期诊断及治疗对降低致残率、提高生活质量至关重要。因此，探讨如何采用影像学方法对SANFH进行早期诊断、指导治疗、判断疗效和预后已成为影像医学研究的重要课题。
首先是定量困难。MR检测的信号强度受到许多因素影响，在不同仪器间缺乏可比性，即使是同一台仪器，2次扫描间信号强度的测定仍会产生明显差异，难以进行准确的量化评价。其次是与SANFH病理生理过程对应困难，MR信号所反映的是骨坏死与骨修复的共同作用，其变化呈现出明显的多样性。此外，股骨头坏死早期MR征象缺乏特异性，与骨髓水肿相对应的股骨头局限性异常信号常被认为是早期阶段的主要MR征象，但其特异性较差，难以与一过性股骨头骨髓水肿等疾病鉴别。
横向驰豫特性的测定是MR定量技术的重要方法，广泛应用于多孔介质不均匀内部微细结构的研究，包括其孔域特征、表面积与体积比等[5]。骨组织因骨小梁网状结构的存在，成为人体中最重要的多孔介质，以骨组织为代表的人体内多孔介质的横向弛豫特性研究逐渐成为热点[6,7]。Fantazzini等[6,8]认为，骨小梁网络结构孔域特征及骨髓组分会对横向弛豫特性产生影响。松质骨骨小梁与骨髓磁化率的不同，会导致两者分界区静态磁场局部空间分布不均匀及磁敏感差异，即表面效应与局部磁场均匀性的变化将导致横向弛豫特性的变化。SANFH病程中出现股骨头骨小梁萎缩、小梁外间隙脂肪堆积以及骨髓缺氧、出血等病理变化，均会影响骨质孔域特征及局部磁场均匀性，使应用MR横向弛豫测定技术研究股骨头坏死骨髓组分及微结构变化成为可能。
对SANFH发病机制的研究证实，长期应用激素最为突出的副作用就是发生骨质减少，导致骨生成减慢，吸收增加，骨量减少，同时出现严重的骨髓脂肪化，出现类似于骨质疏松的病理改变[9,10]。骨质疏松患者的T2及T2*值明显高于无骨质疏松者[11,12]。Maris等[13]在腰椎MR横向弛豫参数与骨密度相关性的研究中，进一步证实T2及T2*值与骨密度呈负相关。本研究发现，SANFH实验动物不同造模时相股骨头骨质横向弛豫参数变化规律与单纯骨质疏松显著不同。在激素造模的不同时相，骨质横向弛豫参数出现了非线性变化，T2、T2*值在造模早期并没有升高，反而出现了减低，在4周时变化最为显著，之后出现回升。对照激素诱导不同时相的股骨头的病理变化发现：在造模早期，股骨头变化主要包括由于缺血所导致的骨和骨髓细胞成分的改变，伴有髓内微血管血栓的形成并出血，此时由于骨小梁骨质吸收而导致骨密度的变化并不显著，T2及T2*值明显的下降主要反映因髓内缺氧及出血所产生的顺磁性物质所致局部磁场均匀性的变化。随着造模时间的延长，股骨头骨小梁出现不同程度的吸收，小梁间隙增大，小梁间脂肪细胞大量增生，造成了骨松质孔域特征的变化，同时加之间质水肿所造成的髓内含水量的增加，在造模中晚期出现了横向弛豫参数的回复。激素造模过程中横向弛豫参数的非线性变化，恰恰反映了SANFH不同阶段股骨头骨及骨髓内复杂的病理变化，反映了骨髓组分及骨小梁微结构的改变。
本课题为MR定量研究SANFH进行了初步的探索，发现了激素暴露下股骨头不同时相、不同区域横向弛豫参数的变化规律，但研究过程中尚存在一些遗憾和局限性。首先，因动物样本量所限，激素暴露早期的研究数据不足，缺乏造模后1周之内横向弛豫参数变化与病理对照的数据，无法了解激素暴露早期横向弛豫的变化规律。其次，病理除形态学描述外，缺乏相关的定量及半定量指标，难以与横向弛豫参数进行相关性研究。因此，激素暴露早期阶段股骨头横向弛豫参数的变化特征，及其与骨髓中脂肪细胞的占比、变性和坏死，骨髓内出血、血栓形成，间质反应以及骨小梁结构和密度等定量指标的相关性研究，成为未来研究的方向。
综上所述，MR横向弛豫时间的变化可敏感地反映出SANFH模型骨髓组分及骨小梁微结构的变化，可以作为常规MRI技术的有益补充，为SANFH早期诊断、指导治疗、判断疗效和预后提供重要的定量影像学方法。
