探讨脐带干细胞移植对大鼠心肌梗死后心脏功能的影响及细胞在心肌内的迁移和分化。
2010年10月—2011年6月收集南京鼓楼医院妇产科10例健康胎儿脐带，采用胶原酶胰酶消化法分离脐带干细胞。选取8周龄、体质量260～280 g的SD雄性大鼠30只，采用结扎大鼠冠状动脉前降支建立心肌梗死模型。造模后第14天行心脏超声检查，将造模成功的大鼠随机分为移植组(12只)和对照组(11只)，并分别经心肌每只大鼠注射200 μl人脐带干细胞悬液和PBS。在细胞移植前和移植后第14、28天行心脏超声心动图检查，测定心脏功能。在移植后28天，处死移植组大鼠，制作心脏冷冻切片。切片采用血管特异性平滑肌动蛋白α(α-SMA)抗体、内皮特异性血管性血友病因子(vWF)抗体及心肌特异性肌钙蛋白T (cTnT)抗体染色，在荧光显微镜下观察脐带干细胞的存活、迁移情况，以及血管平滑肌细胞、血管内皮细胞和心肌细胞的分化情况。
30只大鼠中造模成功23只，脐带干细胞移植后存活20只，其中移植组10只，对照组10只。超声心动检查，与移植前比较，两组大鼠干细胞移植后第14、28天的左室射血分数、短轴缩短率均有明显增加，差异均有统计学意义(t射血分数＝3.864、3.690，t短轴缩短率＝6.397、5.904，P值均<0.05)。移植后组间比较：干细胞移植后第14天，两组大鼠的左心室射血分数差异无统计学意义(P>0.05)，而左室短轴缩短率移植组大于对照组，差异有统计学意义(t＝2.771，P<0.05)；干细胞移植后第28天，移植组大鼠的左室射血分数和短轴缩短率均明显高于对照组，差异均有统计学意义(t＝2.977、2.140，P值均<0.05)。荧光显微镜下观察，移植组可见脐带干细胞能够在梗死心肌内存活并发生迁移，α-SMA抗体、vWF抗体和cTnT抗体染色显示移植的脐带干细胞能够分化为血管平滑肌细胞、内皮细胞和心肌细胞。
脐带干细胞能够在梗死心肌内迁移，在局部梗死心肌微环境下，能够分化为血管平滑肌细胞、内皮细胞和心肌细胞，促进血管新生和心肌再生，从而促进心脏功能的恢复。
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冠状动脉粥样硬化性心脏病发病率高，心肌梗死后心肌再生能力非常有限。虽然有研究表明，成人心脏组织内含有一小部分没有发生终末分化的心肌细胞，在心肌梗死后能够重新进入细胞循环参与心肌再生[1]，但是这种心肌再生并不能有效地阻止心肌梗死的进一步发展[2,3]。干细胞移植，又称细胞心肌成形术，能够促进梗死心肌的再生和功能恢复。为此，胚胎干细胞、造血干细胞、骨骼肌成肌细胞、内皮祖细胞、骨髓间充质干细胞已经先后被用于细胞心肌成形术研究[4]。人脐带中含有丰富的干细胞，笔者通过酶消化法成功分离出人脐带间充质干细胞，该细胞增殖能力旺盛，具有与骨髓干细胞相似的干细胞特征，且更为原始，增殖分化能力更强[5]。本实验旨在研究人脐带干细胞移植对大鼠心肌梗死后心脏功能的影响及脐带干细胞在心肌内的迁移和分化。
DMDM-F12培养基、胎牛血清等细胞培养试剂均购自美国Gibco公司；胶原酶、胰蛋白酶购自美国Sigma公司；荧光活细胞染色剂[氯甲基苯甲酰氨(CM-DiI)]和细胞核染色剂4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(4′，6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)购自美国Invtrogen公司；冷冻切片包埋剂(Opti-mum cutting temperature compound, OCT)购自美国Sakura公司；血管特异性平滑肌肌动蛋白α(α-smooth muscle actin, α-SMA)抗体和内皮特异性血管性血友病因子(von Willebrand factor, vWF)抗体购自丹麦Dako公司，心肌特异性肌钙蛋白T (cardiac troponin T, cTnT)抗体购自美国Lab Vision公司。二抗为羊抗鼠IgG，购自北京中山生物技术公司。冷冻切片机为德国Leica CM1850切片机，动物麻醉呼吸机为江西特力TKR 200型，心脏超声心动仪为德国西门子Sequoia 512型。
2010年10月—2011年6月，经产妇及家属同意，收集南京鼓楼医院妇产科10例无污染的足月剖宫产健康胎儿脐带，采用胶原酶胰酶消化法分离脐带干细胞[5]。将脐带干细胞培养在DMEM-F12培养基中，培养基中含10%胎牛血清、 100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素、2 mmol/L谷氨酰胺、5 μg/L表皮细胞生长因子(epidermal growth factor, EGF)。置于含有5%CO2、37 ℃饱和湿度培养箱中培养。选取培养的第3～5代细胞，在培养3 d细胞达90%融合后，采用CM-DiI活细胞染色剂进行细胞标记。标记方法：将2 μg/mL CM-DiI 5 mL加入到脐带干细胞T75培养瓶中，37 ℃孵育8 min，4 ℃孵育15 min，PBS洗2遍；加入0.25%胰酶/乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid, EDTA)2.5 mL，37 ℃孵育3 min，用PBS重悬细胞，离心半径12.3 cm，1 200 r/min离心3 min，并进行细胞计数，制成浓度为2.5×107/mL的干细胞悬液，保存于4 ℃冰箱中备用。
动物的处置符合动物实验伦理学理念。选取8周龄、体质量260～280 g的SD雄性大鼠30只(北京协和医院动物房提供)，按30 mg/kg戊巴比妥钠溶液腹腔注射麻醉后固定于动物手术台上，分离气管，气管插管后接TKR 200呼吸机辅助呼吸。经第4肋间逐层切开进入胸腔，在左心耳水平下缘用4-0 prolene线结扎左冠状动脉前降支，可见结扎下方心肌颜色变暗，胸腔排气后逐层关闭胸腔。待大鼠自主呼吸平稳后拔除气管插管。术后腹腔内注射青霉素40万U/d，预防感染3 d。造模后第14天行心脏超声检查，以左心室射血分数低于60%为造模成功的标准。采用Excel随机函数生成随机数字，将造模成功的实验大鼠按体重大小依次编号后，与随机数字进行匹配，奇数为移植组，偶数进入对照组。然后将实验大鼠麻醉后固定于手术台，麻醉及插管方法同上，原切口进胸。移植组每只大鼠经心肌注射200 μL人脐带干细胞悬液，对照组则注射200 μL的PBS。术后移植组大鼠每日皮下注射环胞霉素A(10 mg/kg)，预防可能存在的免疫排斥反应，观察时间为术后28 d。
分别在细胞移植前和移植后第14、28天，对所有实验大鼠行心脏超声心动图检查。采用左心室射血分数和左心室短轴缩短率来评价大鼠心功能的恢复情况。
细胞移植后第28天心功能检测完成后，实验大鼠体内微血管采用内皮特异性的凝集素1(BS-1 lectin)标记，然后采用脱颈法处死大鼠，取出心脏，去除心脏表面脂肪组织及大血管，PBS冲洗2遍后，采用OCT包埋剂包埋心脏组织，然后迅速置入液氮中冻存。采用德国Leica CM 1850切片机制作厚度10 μm心脏冷冻切片，在荧光显微镜下观察移植细胞的存活及分布情况。
采用血管特异性α-SMA抗体染色鉴定血管平滑肌细胞分化，内皮特异性vWF抗体染色鉴定血管内皮细胞分化，心肌特异性cTnT抗体染色鉴定心肌细胞分化情况。免疫荧光的步骤：心脏切片用PBS轻轻洗涤2次后，2 %多聚甲醛固定20 min。PBS浸洗1次后，血清封闭30 min，分别加入α-SMA、vWF和cTnT抗体，4 ℃孵育过夜。次日用PBS轻轻浸洗3次，加入二抗，37 ℃孵育30 min，PBS浸洗1次后，采用浓度为1 μg/mL的DAPI染细胞核，共聚焦显微镜下观察。同一切片抗体染色为绿色，CM-DiI标记的脐带干细胞为红色，将2种不同颜色复合可以明确移植细胞的分化情况。
应用SPSS 11.0统计软件进行数据处理。服从近似正态分布的计量资料以
±s表示，采用独立样本t检验；移植前后采用配对分析，本研究计量资料均符合要求采用配对t检验。以P< 0.05为差异有统计学意义。
大鼠心肌梗死模型建立后，大鼠死亡6只，均死于造模后48 h内。存活的24只大鼠在干细胞移植前行超声心动图检查，其中23只大鼠的左室射血分数低于60%(提示造模成功)，随机分入移植组12只、对照组11只。在干细胞移植后有3只大鼠死亡，均死于移植术后48 h内，其中移植组2只、对照组1只，移植组、对照组各存活10只大鼠。
两组大鼠在接受干细胞移植前的超声心动检查左心室射血分数、短轴缩短率差异均无统计学意义(P值均>0.05)。干细胞移植后组内比较：与移植前比较，两组大鼠干细胞移植后第14、28天的左室射血分数、短轴缩短率均有明显增加，差异均有统计学意义(配对检验：t射血分数＝3.864、3.690，t短轴缩短率＝6.397、5.904，P值均<0.05)。组间比较：干细胞移植后第14天，两组大鼠的左室射血分数差异无统计学意义(P>0.05)，而左室短轴缩短率移植组大于对照组，且差异有统计学意义(P < 0.05)；干细胞移植后第28天，移植组左室射血分数、短轴缩短率均大于对照组，差异均有统计学意义(P值均<0.05)。见表1。
两组大鼠干细胞移植前后超声心动指标的比较(%, 
±s)
两组大鼠干细胞移植前后超声心动指标的比较(%, ±s)
| 组别 | 移植前 | 移植后第14天 | 移植后第28天 | ||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 例数 | 射血分数 | 短轴缩短率 | 例数 | 射血分数 | 短轴缩短率 | 例数 | 射血分数 | 短轴缩短率 | |
| 移植组 | 12 | 46.328±3.864 | 48.121±1.941 | 10 | 53.247±2.682a | 54.558±1.912a | 10 | 68.441±4.211a | 56.582±3.763a |
| 对照组 | 11 | 47.303±3.391 | 47.671±1.855 | 10 | 53.892±3.102a | 52.218±1.864a | 10 | 53.251±3.558a | 53.254±3.168a |
| t值 | － | 0.556 | 0.603 | 0.687 | 2.771 | 2.977 | 2.140 | ||
| P值 | － | >0.05 | >0.05 | >0.05 | <0.05 | <0.01 | <0.05 | ||
注：与同组移植前比较，经配对t检验，aP<0.05
移植后第28天心肌冰冻切片荧光显微镜下观察，梗死心肌内可见CM-DiI标记的脐带干细胞，细胞多集中在注射部位的心内膜或心外膜组织内(图1A)，并开始向周围心肌组织迁移、游走，分散在心肌组织内(图1B)。对大鼠的微血管进行BS-1 lectin染色后，发现脐带干细胞聚集在毛细血管网周围(图1C)。
共聚焦显微镜下血管特异性α-SMA抗体染色显示：血管平滑肌中肌动蛋白染色阳性呈绿色，同一切片中CM-DiI标记的脐带干细胞呈红色；其中部分脐带干细胞表达血管平滑肌特异性α-SMA抗体，分化为血管平滑肌细胞，参与血管重建。见图2。
共聚焦显微镜下血管内皮细胞特异性vWF抗体染色显示：微血管表达vWF，为绿色；CM-DiI标记的脐带干细胞为红色；部分移植的脐带干细胞vWF染色阳性，分化为内皮细胞，参与血管新生。见图3。
共聚焦显微镜下心肌细胞特异性cTnT染色显示：心肌细胞被cTnT抗体染成绿色，CM-DiI标记的脐带干细胞为红色，脐带干细胞表达cTnT，分化为心肌细胞，参与局部梗死后心肌的再生。见图4。
有研究表明，干细胞能够在梗死心肌微环境下向缺血梗死区迁移并与宿主心肌细胞融合，刺激新生血管生成，减少心肌细胞凋亡，改善心脏的功能[6]。骨髓来源的干细胞具有自体来源的优势，研究也最多[7,8]。但是，骨髓来源的干细胞可随人体老化，其数量和增殖能力显著降低，而且如果患者出现病毒感染或合并其他疾病，都会影响骨髓来源的干细胞的功能。因此，寻找新的干细胞来源有着重要意义。脐带组织来源丰富，采集分娩后脐带来源的干细胞对胎儿和母亲没有不良影响。笔者采用胶原酶胰酶消化法成功地从脐带组织中分离出具有间充质干细胞特性的脐带干细胞，体外增殖能力旺盛，能够分化为心肌细胞和内皮细胞[5]。目前较好的细胞冻存技术，使得细胞能够冻存和随时使用，具有较好的应用前景。
在本研究中，笔者以人胎儿脐带干细胞为种子细胞，研究脐带干细胞移植后能否促进心脏功能的恢复。本研究结果显示，两组大鼠在干细胞移植后第14、28天的左心室射血分数、短轴缩短率与移植前比较，均有明显增加；在脐带干细胞移植后第14天，移植组的短轴缩短率较对照组明显改善；移植后第28天，移植组的左心室射血分数和短轴缩短率均较对照组明显改善，说明脐带干细胞移植能够促进心肌梗死后心脏功能的恢复。笔者前期研究发现，脐带干细胞移植到下肢缺血模型中，能够分化为内皮细胞，促进血管新生[9]；进一步研究发现，脐带干细胞能够通过旁分泌作用参与血管重建[10]。本研究发现，移植后脐带干细胞能够向梗死心肌周围组织迁移；血管平滑肌特异性α-SMA鉴定显示，脐带干细胞能够分化为血管平滑肌细胞，说明参与血管重建；内皮特异性vWF鉴定显示，部分移植的脐带干细胞分化为内皮细胞，说明脐带干细胞移植不仅能够通过旁分泌作用，而且可以通过体内直接分化为内皮细胞，促进血管新生。
Orlic等(2001)最早通过建立急性心肌梗死模型，证明移植的骨髓干细胞能够通过心肌分化(再生)形成新生心肌组织，促进心脏功能恢复。在本实验中，通过观察cTnT的表达，证明脐带干细胞移植后也能够在局部心肌微环境下分化为心肌样细胞，从而增加心肌细胞的数量，参与局部梗死后心肌的再生。
经过本实验研究，笔者认为脐带干细胞移植后能够在心肌内存活并发生迁移，在局部心肌微环境下，能够分化为血管平滑肌细胞、内皮细胞和心肌细胞，参与体内的血管新生、血管网重建和心肌的再生，从而促进心肌梗死后心脏功能的恢复。本研究的局限性在于没有对干细胞在体内的迁移分布和具体的分化机制进行研究，有待进一步研究。心肌梗死后，如何再生出足够多的心肌细胞以替代坏死的心肌细胞也是进一步研究的方向[11]。最新研究显示，诱导多能干细胞具有分化的全能性和高效性，而且可以自体来源[12]，该研究为未来干细胞和心血管基础研究开辟了新的天地。
