探讨改良体外分离、培养、扩增、纯化SD大鼠毛囊干细胞(rHFSCs)及其免疫、超微结构的鉴定方法，观察rHFSCs的生物学特性及成脂、成骨分化能力。
2015年1—6月选取清洁级1周龄SD大鼠6只，在无菌条件下切取SD大鼠触须部皮肤，用Dispase酶和Ⅳ型胶原酶混合液消化，显微镜下分离毛囊隆突部，用梯度加液组织块贴壁法培养rHFSCs，用两步酶消化法传代，用Ⅳ型胶原差速贴壁法纯化rHFSCs。收集第3代rHFSCs，采用流式细胞术、免疫荧光染色及透射电镜观察rHFSCs内部结构等方法鉴定rHFSCs。收集第1～10代rHFSCs检测细胞活力，第3、5、7、9代rHFSCs培养第1～8天时检测细胞增殖能力。收集第3代rHFSCs，按培养液的不同分为诱导组和对照组，对比两组目的基因PPAR-γ、C/EBPa、OPG、Runx2的相对表达量及染色后的光密度(OD)值变化情况，观察rHFSCs的成脂、成骨分化能力。
通过改良方法分离、培养、纯化的rHFSCs呈典型的铺路石状，生长曲线呈"S"形，生长增殖能力良好，克隆形成能力强。透射电镜显示细胞处于原始状态。流式细胞术检测显示Integrin β1、Integrin α6、P63呈高表达，CK15呈中等表达，符合rHFSCs标记鉴定特点。免疫荧光染色和透射电镜观察rHFSCs内部结构证明细胞的类型属于毛囊干细胞。rHFSCs成脂诱导培养7 d后RFqPCR定量结果显示，诱导组目的基因PPAR-γ、C/EBPa的相对表达量(5.598±0.168、4.757±0.416)均明显高于对照组(1.119±0.344、1.126±0.355)，差异均有统计学意义(t＝34.955、20.266，P值均<0.01)；诱导14 d后细胞油红O染色阳性，诱导组OD值(2.472±0.091)明显高于对照组(0.817±0.003)，差异有统计学意义(t＝114.641, P<0.05)。rHFSCs成骨诱导培养14天后RFqPCR定量结果显示，诱导组目的基因OPG和Runx2的相对表达量(1.921±0.275，3.892±0.265)明显高于对照组(1.085±0.288，1.046±0.216)，差异均有统计学意义(t＝4.667、17.332, P值均<0.01)；诱导21 d后细胞茜素红染色阳性，诱导组OD值(0.716±0.016)明显高于对照组(0.076±0.002)，差异有统计学意义(t＝14.078, P<0.01)。
采用改良体外分离、培养、扩增、纯化方法可成功建立rHFSCs体外培养体系，rHFSCs具有纯度大、增殖效率高、多向分化潜能强等特点，可为干细胞组织工程学相关发展提供良好的种子细胞。
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皮肤作为人体与外界环境之间的第一道屏障，是免疫系统的重要组成部分；不仅能感受外界的刺激，调节体温和体液的排泄，也能阻止理化伤害和阻断病原微生物的侵袭[1]。因外伤、感染，特别是烧伤、压轧伤、切割伤等导致的皮肤大面积缺损的治疗是目前临床治疗上的难点之一。近年来，干细胞用于皮肤伤口的修复越来越受到关注，筛选适宜的种子细胞被认为是在组织工程皮肤构建中最简单有效的方法之一[2]。毛囊干细胞(hair follicle stem cells, HFSCs)作为一种具有未分化性、自我更新和体外增殖能力强等特点的干细胞，存在于毛囊外根鞘隆突部，具有形成毛囊组织、神经细胞、黑色素细胞、表皮层细胞、血管平滑肌细胞及结缔组织等多向分化潜能[3,4,5,6,7]。2015年1—6月，笔者通过改良体外分离培养、扩增方法培养纯化SD大鼠毛囊干细胞(rat hair follicle stem cells, rHFSCs)，采用流式细胞术、免疫荧光染色及透射电镜观察rHFSCs内部结构等方法鉴定rHFSCs，并对其增值能力、活力和多向分化潜能进行研究，旨在高效获取高纯度的毛囊干细胞，为后期加速伤口愈合及组织工程皮肤早期血管化的研究提供实验依据。
清洁级1周龄SD大鼠6只，雌雄不拘，体质量(24±4)g，由浙江省实验动物中心提供，实验动物许可证号：SCXK(浙)2014-0001。
DMEM/F12(1∶1)培养基、KnockOut™血清替代物(KnockOut™ serum replacement, KSR)、Ⅳ 型胶原酶、Dispase酶、Coating Matrix Kit试剂盒、TrypLE™ Select(1×)胰蛋白酶替代酶、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、羟基乙醇(美国Gibco公司)；重组人表皮细胞生长因子(epidermal growth factor, EGF)、重组人碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)(美国R&D公司)；青-链霉素混合液、牛胰岛素(北京索莱宝科技有限公司)；氢化可的松、台盼蓝染色剂(上海生工生物工程有限公司)；Ⅳ型胶原(美国BD公司)；CCK-8试剂盒(杭州诺杨生物科技有限公司)；Integrin β1抗体(美国Biolegend公司)；Integrin α6抗体(美国Santa Cruz公司)；Keratin-15、P63抗体(美国abcam公司)；4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(4′，6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)(德国Roche公司)；地塞米松、吲哚美辛、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、油红O、茜红素、β-甘油磷酸钠、抗坏血酸(美国sigma公司)；Trizol RNA提取试剂、反转录酶、Taq DNA聚合酶 (美国Invitrogen公司)；实时荧光定量PCR(real time quantitative PCR, RT-qPCR)反应试剂盒(美国ABI公司)。细胞CO2培养箱(美国，Thermo Scientific)；微量移液器(德国，Eppendorf)；酶标仪、荧光定量PCR仪(美国，Bio-Rad)；激光共聚焦显微镜(德国，Carl Zeiss)。所有引物合成由上海桑尼生物科技有限公司完成，引物序列及产物长度见表1。
各基因引物序列及产物长度
各基因引物序列及产物长度
| 引物名称 | 引物序列 (5′→3′) | 产物长度(bp) |
|---|---|---|
| PPAR-γ | 上游 GTGGGGATGTCTCACAATGC | 203 |
| 下游 TTTCCTGTCAAGATCGCCCT | ||
| C/EBPa | 上游 GGCGGGAACGCAACAACA | 290 |
| 下游 GATCCAGCGACCCTAAACCATC | ||
| OPG | 上游 GGACGTCAGCTCTTGTGTGA | 245 |
| 下游 AATTCGAGCTCCAGGTAGCG | ||
| Runx2 | 上游 GGCCAGGTTCAACGATCTGA | 233 |
| 下游 TACTGGGATGAGGAATGCGC | ||
| GAPDH | 上游 GTATGACTCTACCCACGGCA | 162 |
| 下游 AAGACGCCAGTAGACTCCAC |
1.3.1 预包被培养皿 根据Coating Matrix Kit试剂盒说明书，按照适当比例配制成混合液包被培养皿，室温静置30 min后吸弃混合液，此时经包被过的培养皿直接用。
1.3.2 rHFSCs的分离培养取1周龄SD大鼠，颈椎脱臼法处死，放入装有75%乙醇的烧杯消毒后取出。在超净台中，用眼科剪剪短触须并剪下触须部皮肤，75%乙醇漂洗1次，再用PBS漂洗3次。然后用1%Ⅳ 型胶原酶和1% Dispase酶混合液37 ℃ 消化90 min后，用PBS洗2次。体视显微镜下用1 mL注射器针头将毛囊脱鞘，切去两端，留下隆突部，将毛囊隆突部接种到预先包被的培养皿中，加入1 mL完全培养基(869 μL/mL DMEM/F12、100 μL/mL KSR、10 μL/mL青、链霉素混合液、10 μL/mL L-谷氨酰胺、10 μL/mL非必需氨基酸、20 ng/mL EGF、10 ng/Ml bFGF、1 μL/mL羟基乙醇、10 ng/mL氢化可的松)，37 ℃、5% CO2培养条件下培养1 h，再缓缓加入2 mL完全培养基继续培养3 h。待组织基本贴壁后继续缓慢加入3 mL完全培养基，之后每2～3 d换液，倒置相差显微镜下观察细胞生长、迁移、克隆的情况。
1.3.3 rHFSCs的传代扩充及纯化 原代细胞培养8～10 d即可进行传代扩增：用胰蛋白酶(0.25%Trypsin＋0.02%EDTA)-PBS稀释液(1∶3)漂洗3次，再用TrypLE™ Select(1×)胰蛋白酶替代酶37 ℃、5% CO2培养箱中消化约8 min。对参考文献[8－9]的方法加以改良，将消化离心所得的细胞吹打成单悬液接种于预先在室温状态下用Ⅳ型胶原包被1 h的培养皿中，15～20 min后将未贴壁细胞吸出；贴壁细胞继续用完全培养基培养，每2～3 d换液1次。待细胞生长到约90%融合，符合传代状态时，用相同方法再纯化1次。在倒置相差显微镜下观察rHFSCs原代细胞和第3代细胞的形态。
1.3.4 流式细胞术鉴定 使用流式细胞仪鉴定rHFSCs的特征性标记物Integrin β1、Integrin α6、CK15和P63。收集第3代rHFSCs，调整细胞密度为1.0×106个/mL，装入1.5 mL的EP管，600×g离心3 min，弃上清。用80%甲醇将细胞室温固定5 min后，加0.1%磷酸盐吐温缓冲液(phosphate buffered saline with tween-20, PBST)室温静置20 min，再加5%牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)-PBS上摇床封闭30 min，PBS洗1次，600×g离心3 min，弃上清。每管流式管加入1×膜联蛋白结合缓冲液100 uL和1×106细胞。分别加入Integrin β1、Integrin α6、CK15、P63抗体避光孵育30 min。加入荧光素标记羊抗鼠、兔抗鼠二抗避光孵育30 min。PBS洗1次，600×g离心3 min，弃上清。每管流式管加PBS 500 μL，上机流式检测。同时每管样品设立同型阴性对照。实验检测重复3次。
1.3.5 免疫荧光染色鉴定 收集第3代rHFSCs，按1.0×103个/孔浓度接种于玻片上，做细胞爬片。37 ℃、5%CO2培养2 d后，吸去培养液，PBS漂洗3次，加入4% 多聚甲醛(paraformaldehyde, PFA)-PBS固定10 min，再用5% BSA-PBS室温封闭30 min。分别加入1∶50的Integrin β1、Integrin α6抗体和1∶100的CK15、P63抗体，阴性对照组以PBST代替一抗。然后4 ℃孵育过夜(12～16 h)，PBST洗涤后，加入荧光素标记羊抗鼠、兔抗鼠二抗避光 孵育30 min；加DAPI(1∶2 000)染核10 min。然后避光晾干封片，激光共聚焦显微镜下观察rHFSCs特征性标记物Integrin β1、Integrin α6、CK15和P63的荧光表达情况。
1.3.6 透射电镜观察内部结构 取第3代rHFSCs，2.5%戊二酸PBS冲液将消化离心所得的细胞固定过夜。经过0.1 mol/L PBS漂洗，1%锇酸固定1 h，ddH2O漂洗，2%醋酸铀固定/染色30 min，50%、70%、90%、100%乙醇及100%丙酮梯度脱水，再经过渗透、包埋、聚合3个过程。最后超薄切片机切片，切片厚度70 nm，醋酸铀－柠檬酸铅染色，透射电镜下观察rHFSCs内部结构。
1.3.7 细胞活力及增殖能力检测 在第1～10代rHFSCs培养至约90%融合，消化传代过程中取10 μL细胞悬液与10 μL 0.4%的台盼蓝染色剂混合均匀后，滴入细胞计数板上统计活与死的细胞数计算活细胞率，重复3次后取平均值。活细胞率(%)＝活细胞/(活细胞＋死细胞)×100%。
取第3、5、7、9代rHFSCs，分别于实验第1、2、3、4、5、6、7、8天加入细胞计数试剂Kit-8(cell counting Kit-8，CCK-8)孵育2 h，用酶标仪在450 nm波长处测定光密度(optical density, OD)值，每个时间点设置6个复孔，结果取平均值，绘制细胞生长曲线。
1.3.8 成脂分化与鉴定 取第3代rHFSCs，接种于6孔板中培养，待细胞贴壁生长80%融合时，运用成脂诱导液培养为诱导组，以原完全培养基培养为对照组。成脂诱导液：原完全培养基(去掉bFGF、EGF)＋1 μmol/L地塞米松、500 μmol/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、10 μg/mL牛胰岛素、200 μmol/L吲哚美辛。两组rHFSCs培养7 d后观察记录形态学变化，并对目的基因PPAR-γ、C/EBPa进行RFqPCR检测。PPAR-γ、C/EBPa和内参基因GAPDH的引物设计由Primier 5.0软件完成。先按照Trizol RNA提取试剂盒说明书提取各组细胞总RNA，反转录后得到cDNA，最后定量PCR反应体系为25 μL：2×qPCR Mix 12.5 μL、7.5 μmol/L基因/内参引物2 μL、反转录产物2.5 μL、ddH2O 8 μL。PCR扩增：退火温度结合引物的Tm值及RFqPCR预实验结果自行设定，融解曲线设置从75 ℃开始，每20 s升温1 ℃，最后用2－△△Ct法检测2组目的基因PPAR-γ、C/EBPa的相对表达量，并进行比较。rHFSCs培养14 d后经漂洗、固定、脱水后进行油红O染色过程，在倒置相差显微镜下观察红色脂滴，最后溶解染料在酶标仪上测定诱导组和对照组OD值并进行比较。
1.3.9 成骨分化与鉴定 取第3代rHFSCs，接种于6孔板中培养，待细胞贴壁生长80%融合时，运用成骨诱导液培养为诱导组，以原完全培养基培养为对照组。成骨诱导液：原完全培养基(去掉bFGF、EGF)＋0.1 μmol/L地塞米松、50 μg/mL抗坏血酸、10 mmol/L甘油磷酸钠。两组rHFSCs培养14 d后观察记录形态学变化，并对目的基因OPG、Runx2进行RFqPCR检测，检测步骤条件和设备与成脂RFqPCR检测相同，最后用2－△△Ct法检测两组目的基因OPG、Runx2的相对表达量，并进行比较。两组rHFSCs在培养21 d后细胞经漂洗、固定后进行茜红素染色，在倒置相差显微镜下观察橘红色钙结节，最后溶解染料在酶标仪上测定诱导组和对照组OD值并进行比较。
应用SPSS 18.0统计软件分析。服从近似正态分布的计量资料以
±s表示，采用t检验和方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。
改良后组织块培养法下的毛囊隆突部2～3 d开始爬出细胞，6～7 d细胞数量增加；原代细胞排列紧密，呈铺路石状分布。经过Ⅳ型胶原差速贴壁法分选后的第3代细胞与原代细胞形态一致，且呈典型的铺路石状，折光度高、立体感好、克隆性强，具有典型的干细胞生物学特性。见图1。
对rHFSCs的特征性标记物进行流式细胞术检测，结果显示：Integrin β1阳性率为98.9%(98.87%±0.21%), Integrin α6阳性率为97.9%(97.90%±0.33%)，P63阳性率为98.5%(98.50%±0.16%)，CK15阳性率为68.1%(66.87±1.17%)。rHFSCs高表达特征性标记物Integrin β1、Integrin α6、P63，中等表达CK15。符合rHFSCs标记鉴定特点[10,11,12,13]。见图2。
对rHFSCs进行细胞免疫荧光染色结果显示：细胞膜蛋白Integrin α6、Integrin β1的阳性表达均为红色荧光，细胞质蛋白CK15和细胞核蛋白P63的阳性表达均为绿色荧光，DAPI对细胞核的染色为蓝色荧光。通过对rHFSCs特征性标记物的免疫荧光染色鉴定，证明了该细胞的类型属于毛囊干细胞。见图3。
透射电镜下可见细胞核大，核仁明显，核质比例大，细胞器少而发育不成熟，是处于原始状态的细胞。见图4。
第1～10代rHFSCs进行细胞活力检测显示：第1～6代细胞的活力强，活细胞率分别为98.8%±0.40%、97.63%±0.42%、96.63%±0.45%、94.93%±0.47%、93.97%±0.57%、92.57%±0.47%，均在90%以上；第7～9代细胞活力减弱，活细胞率分别为88.33%±0.75%、85.87%±0.31%、80.43%±0.75%, 在80%～90%之间；而第10代细胞活力明显下降，活细胞率为74.60%±0.51%，但仍大于70%。
CCK-8细胞增殖检测结果显示：纯化后第3、5、7、9代细胞在最初2 d内处于潜伏状态，OD值保持在1.35～1.37之间。第3天均出现克隆增殖，并在第4～6天细胞处于对数生长期，在第6天时，第3代细胞OD值达到约1.6，克隆能力最强，后逐代降低，到第9代OD值约1.5。第7天增殖能力均开始减弱，第8天进入平台期。每代细胞的生长曲线都呈"S"形，且第3代细胞增殖能力最强，后逐代次之。见表1、图5。
不同代的rHFSCs培养1～9 d的增殖能力OD值结果的比较(
±s)
不同代的rHFSCs培养1～9 d的增殖能力OD值结果的比较(±s)
| 代数 | 样本数 | 1 d | 2 d | 3 d | 4 d | 5 d | 6 d | 7 d | 8 d |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 3 | 6 | 1.364±0.003 | 1.376±0.004 | 1.413±0.007 | 1.465±0.010 | 1.517±0.014 | 1.588±0.023 | 1.568±0.016 | 1.552±0.014 |
| 5 | 6 | 1.365±0.004 | 1.378±0.006 | 1.407±0.010 | 1.452±0.011 | 1.503±0.016 | 1.564±0.026 | 1.545±0.020 | 1.524±0.023 |
| 7 | 6 | 1.366±0.006 | 1.367±0.007 | 1.393±0.008 | 1.444±0.009 | 1.483±0.012 | 1.550±0.017 | 1.538±0.021 | 1.528±0.018 |
| 9 | 6 | 1.366±0.003 | 1.369±0.005 | 1.384±0.007 | 1.424±0.011 | 1.468±0.014 | 1.508±0.025 | 1.495±0.018 | 1.487±0.016 |
注：rHFSCs：大鼠毛囊干细胞；OD：光密度
rHFSCs诱导7 d后RFqPCR定量结果显示：在成脂分化中起重要作用的两个目的基因PPAR-γ和C/EBPa的相对表达量增加明显，诱导组PPAR-γ、C/EBPa表达均明显高于对照组，差异均有统计学意义(P值均<0.01)。验证了rHFSCs有诱导成脂的潜能。
rHFSCs诱导7 d后，倒置相差显微镜下显示细胞变圆形或多边形，体积变大，胞浆内开始出现少许折光性强的圆形小脂滴。诱导14 d后，细胞质内的脂滴不断增多增大，经油红O染色可见脂滴被染成红色，而对照组可见少许脂滴存在。进一步对染色后的脂滴染料溶解，在酶标仪上测定OD值，显示诱导组OD值明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)。见表2、图6。
诱导组和对照组目的基因PPAR-γ、C/EBPa、OPG、Runx2的相对表达量和油红O、茜红素染色OD值比较(
±s)
诱导组和对照组目的基因PPAR-γ、C/EBPa、OPG、Runx2的相对表达量和油红O、茜红素染色OD值比较(±s)
| 组别 | 样本数 | PPAR-γ | C/EBPa | 油红O染色OD值 | OPG | Runx2 | 茜红素染色OD值 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 对照组 | 3 | 1.119±0.344 | 1.126±0.355 | 0.817±0.003 | 1.085±0.288 | 1.046±0.216 | 0.076±0.002 |
| 诱导组 | 3 | 5.598±0.168 | 4.757±0.416 | 2.472±0.091 | 1.921±0.275 | 3.892±0.265 | 0.716±0.016 |
| t值 | － | 34.955 | 20.266 | 114.641 | 4.667 | 17.332 | 14.078 |
| P值 | － | <0.01 | <0.01 | <0.01 | <0.01 | <0.01 | <0.01 |
注：OD：光密度
毛囊干细胞来源于毛发和皮肤，数量可观，无免疫原性，可供自体移植，是最容易获得的成体干细胞来源之一，尤其在组织工程皮肤等研究中作用尤为突出；因其具有分化为脂肪、软骨、骨、神经元和神经胶质细胞、造血细胞等潜能，在其他领域也有不少的研究价值[14,15]。很多实验研究证明，毛囊隆突部位是毛囊干细胞存在的主要场所，是极具潜能的干细胞库，其将成为再生医学发展中不可或缺的高效且适宜的种子细胞[10,16,17,18,19]。
已有研究者在体视显微镜下分离得到毛囊隆突部，运用组织块培养法成功获取了毛囊干细胞[20,21]，但是多存在单个毛囊隆突部出产毛囊干细胞的效率欠佳，传代过程中细胞难以消化，导致消化时间过长而损伤细胞等不足。为了得到高纯度、体外扩充能力强的毛囊干细胞，本实验改良为运用梯度加液组织块贴壁培养和两步酶消化法传代，使毛囊隆突部在4 h内通过缓慢梯度增加培养基而达到快速贴壁的目的，让组织块中的细胞能尽早获取营养，结果发现：单个毛囊产出的毛囊干细胞的速率和成功率明显提高；而运用胰蛋白酶-PBS稀释液(1∶3)漂洗，再用TrypLE™ Select(1×)胰蛋白酶替代酶消化传代，不仅增加了细胞消化率，消化时间缩短，也减小了对细胞的损伤，更有利于细胞的克隆传代；培育出来的rHFSCs呈典型的铺路石状，折光度高、立体感好、克隆性强。本研究对不同代细胞进行增殖能力和活力检测发现，所得细胞经历了潜伏期、开始克隆增殖、对数生长期、增殖减弱及平台期，生长曲线呈明显"S"形，符合干细胞的生长特性；而随着传代次数的增加，其增殖能力和活力也逐渐下降，但台盼蓝拒染实验显示前6代细胞的活力仍保持在90%以上。为了能更直观地观察原始干细胞的内部结构，实验又进行了透射电镜超微结构扫描，发现细胞核大，核仁明显，核浆比例大，细胞器少，表面分布大量微绒毛，具有典型的未分化细胞特征。
由于毛囊的结构和其细胞组成的复杂性，当前对毛囊干细胞的鉴定尚无一种确切可靠的特异性标记物。已有研究表明，整合素家族表达率越高，目的细胞的干性更强，分化程度越低[11]。Integrin α6、Integrin β1都是公认的HFSCs表面标记物，并常和其他标记物用来联合鉴定毛囊干细胞[10,11,12,13]。也有研究发现，利用毛囊干细胞特异性标记物CK15，结合免疫荧光标记及流式细胞术检测，能在相对较短的时间内对毛囊干细胞进行高通量和更为精确的分离[22]。P63是肿瘤抑制因子之一，也是表皮干细胞的一种特异性标记物，因毛囊隆突部也存在表皮干细胞，P63也被认为是鉴定HFSCs的一种有效的标记物[23]。本研究结果显示Integrin α6、Integrin β1、P63强阳性表达，阳性率均在90%以上；CK15中高等表达，阳性率不低于60%；细胞免疫荧光染色经激光共聚焦显微镜拍摄，观察到4个标记物的表达位置和强弱。通过本研究培养体系，最终得到了相对高纯度的rHFSCs。
具有多向分化潜能是干细胞需具备的特征，也是其干性能力的一种鉴定手段。张志强等[24]利用两步酶消化法获得毛囊干细胞，并对其成脂、成骨诱导，结果证实了所获取的细胞具有多向分化潜能，但是分化能力尚有限。本研究结果显示：rHFSCs成脂诱导培养7 d，诱导组成脂相关基因PPAR-γ、C/EBPa的相对表达均明显高于对照组；诱导培养14 d，绝大部分的HFSCs油红O染色阳性，脂滴明显，诱导组OD值明显高于对照组(P<0.01)。rHFSCs成骨诱导培养14 d，诱导组目的基因OPG和Runx2的相对表达量明显高于对照组(P<0.01)；诱导培养21 d，在茜红素染色后，钙结节呈现也较为广泛，这种矿化结节是公认的成骨细胞分泌的功能指标[25]，同时诱导组OD值明显高于对照组(P<0.01)。本研究结果提示，rHFSCs具备较强的向成脂细胞和成骨细胞分化的能力，具备成体干细胞的特性。
综合上述，运用改良体外分离、培养、扩增纯化等高效技术体系获得的rHFSCs具有增殖效率高、纯度大、多向分化潜能强等优势。这将为干细胞组织工程学相关发展提供良好的种子细胞打下坚实的基础；为组织工程皮肤用于创面修复，如治疗烧伤、压轧伤、切割伤等导致的皮肤大面积缺损提供有力的实验依据[26]；也为本课题组在今后的定向分化研究，促进早期血管化，构建人工皮肤，加速创面修复提供了高效的种子细胞。但本研究也存在不足之处，如只运用了公认的基础配方对rHFSCs进行了成脂、成骨的分化能力的观察，尽管从实验结果可以证明其具备多向分化的潜能，但是其成骨的能力还有待开发。今后实验组将优化成骨诱导配方，以提高其成骨分化的潜能，也有望通过添加诱导因子或细胞共培养等手段开发rHFSCs其他定向分化的能力，为干细胞组织工程学做出贡献。
