Effects of cinobufacini on radiosensitivity of Bel-7402 hepatocellular carcinoma cells and its mechanisms

Zhu Yanyan; Wang Zhaojie; Ma Ning; Zhou Jianwei

doi:10.3760/cma.j.issn.2095-7041.2018.02.015

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• 实验研究 •

华蟾素对肝癌Bel-7402细胞放疗敏感性的影响及其作用机制的研究

中华解剖与临床杂志, 2018,23(2) : 160-165. DOI: 10.3760/cma.j.issn.2095-7041.2018.02.015

摘要

目的

探讨华蟾素对肝癌Bel-7402细胞放疗敏感性的影响及其作用机制。

方法

分别使用浓度为0.125、0.250、0.500、1.000 μg/mL华蟾素处理肝癌Bel-7402细胞24 h、48 h、72 h，噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖的影响，根据半数抑制浓度(IC₅₀)选择华蟾素浓度及作用时间。用0 μg/mL(对照组)和0.4 μg/mL华蟾素处理肝癌Bel-7402细胞，同时用剂量为0、2、4、6、8 Gy的6 MV X线进行照射，克隆形成实验检测细胞放疗敏感性。用IC₅₀为0.4 μg/mL华蟾素、6 Gy的X线分别单独或联合处理肝癌Bel-7402细胞，48 h后流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡率；Western blot检测细胞中p50、p65、Bcl-2、cyclin D1蛋白表达情况。

结果

华蟾素能够显著抑制肝癌Bel-7402细胞增殖，随着作用浓度的增加及作用时间的延长，细胞抑制率逐渐升高。华蟾素能够抑制经照射后的肝癌Bel-7402细胞克隆形成能力，细胞存活率显著低于对照组(P<0.05)。与对照组相比，华蟾素组、放疗组及联合组肝癌Bel-7402细胞G0/G1期细胞比例增多，S期细胞减少，细胞凋亡率升高，p50、p65、Bcl-2和cyclin D1蛋白表达降低，差异均有统计学意义(P值均<0.05)；联合组与华蟾素组和放疗组相比，细胞周期、细胞凋亡率及蛋白表达差异均有统计学意义(P值均<0.01)。

结论

华蟾素能够增强肝癌Bel-7402细胞的放疗敏感性；其作用机制可能与华蟾素能够通过抑制核因子-κB信号通路及下调Bcl-2和cyclin D1蛋白表达，进而抑制细胞增殖、诱导细胞周期阻滞和细胞凋亡相关。

引用本文: 朱琰琰, 王朝杰, 马宁, 等. 华蟾素对肝癌Bel-7402细胞放疗敏感性的影响及其作用机制的研究 [J] . 中华解剖与临床杂志,2018,23 (2): 160-165. DOI: 10.3760/cma.j.issn.2095-7041.2018.02.015

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据世界卫生组织公布，原发性肝癌是十大恶性肿瘤之一，在全球癌症的病死率中居第三位，严重威胁人类健康^[1]。肝癌的主要治疗方法有手术、放疗、化疗、分子靶向治疗等^[2]。肝癌发病隐匿且发展速度较快，因此，大部分患者确诊时已处于癌症晚期，不适合进行手术治疗。近年来，随着三维适形放疗等技术的发展，放射治疗在肝癌治疗中的作用日渐受到重视，已成为晚期肝癌的主要治疗方法之一^[3]；但由于存在放疗耐受及某些肝癌细胞的放疗敏感性较低等原因，其疗效不是很理想。因此，开发新的放疗增敏剂，提高肿瘤放疗效果，是目前亟待解决的热点问题之一。

相关研究结果显示，中药联合放疗可以提高放疗敏感性，减轻放疗不良反应^[4,5]。华蟾素是以中药中华大蟾蜍皮为主要原料，经加工制成的水溶性制剂。研究证实，华蟾素可抑制多种肿瘤细胞的生长^[6,7]，并发现其具有放疗增敏作用^[8]；然而，华蟾素联合放疗在肝癌治疗中的研究较少。本实验检测华蟾素或化疗单独或联合对肝癌细胞周期、凋亡的影响，旨在探讨华蟾素对肝癌细胞的放疗增敏作用及其机制。

1　材料与方法

1.1　主要实验材料

人肝癌Bel-7402细胞购于上海中国科学院细胞库；RPMI 1640培养基、胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)购于美国Gibco公司；华蟾素注射液购于安徽金蟾生化股份有限公司(国药准字Z34020273，每支5 mL) ；噻唑蓝(methylthiazoly teerazolium, MTT)、Annexin-V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购于上海生工生物工程有限公司；细胞周期检测试剂盒购于美国Promega公司；兔抗人p50、p65 、Bcl-2和cyclinD1单克隆抗体购于美国Cellsignal公司；兔抗人GAPDH抗体及辣根过氧化物酶标记的二抗购于美国Santa Cruz公司；细胞蛋白提取试剂盒、BCA蛋白浓度检测试剂盒购于上海碧云天生物技术研究所；TC2323型CO₂培养箱购于美国Sheldon公司；倒置显微镜购于日本Olympus；全自动酶标仪购于美国Thermo Fisher公司；FACSCantoⅡ分析型流式细胞仪购于美国BD公司；蛋白化学发光凝胶成像系统Fluor Chem E购于美国Protein Simple公司。

1.2　实验方法

1.2.1　细胞培养

从液氮罐中取出冻存的肝癌Bel-7402细胞，迅速放入37 ℃水浴锅中解冻，将细胞转移到无菌离心管中，加入3 mL RPMI 1640完全培养液(含10 % FBS)，离心半径6 cm，1 200 r/min离心5 min，去除上清。向细胞沉淀中加入RPMI 1640完全培养液吹打重悬细胞，吸出细胞悬液，接种到经紫外线照射灭菌的细胞培养皿中，置于37 ℃，5% CO₂培养箱中培养；24 h后进行换液，去除漂浮的死细胞，之后每2～3 d换液1次；待细胞融合度达到80%以上时，用0.25%胰蛋白酶消化，细胞收缩变圆后加入完全培养基终止消化，收集细胞，按1∶3将细胞接种至新的细胞培养板中传代培养。

1.2.2　MTT检测华蟾素对肝癌Bel-7402细胞增殖的影响

收集对数生长期的肝癌Bel-7402细胞，用0.25%胰蛋白酶消化，使细胞呈单个存在。用RPMI 1640完全培养液重悬细胞，计数并调整细胞浓度为1×10⁴/mL，每孔200 μL接种于96孔板中，培养24 h后，弃去培养液，加入含有终浓度为0.125、0.250、0.500、1.000 μg/mL华蟾素的RPMI 1640完全培养液继续培养，同时设置对照组(含有细胞和培养液，不含华蟾素)和空白组(含有培养液，不含细胞和华蟾素)。分别在培养24、48、72 h后，每组选择6孔细胞，每孔加入0.5% MTT溶液20 μL，继续培养4 h后弃上清，加入150 μL二甲基亚砜，避光低速震荡10 min，待蓝紫色结晶溶解后，用空白孔调零，全自动酶标仪在490 nm波长处测定各孔细胞的吸光度(absorbance, A)值，并计算细胞抑制率。

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根据半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration, IC₅₀)计算软件计算华蟾素作用于肝癌Bel-7402细胞48 h的IC₅₀，取IC₅₀作为后续实验浓度。

1.2.3　克隆形成试验检测华蟾素对肝癌Bel-7402细胞放疗敏感性的影响

对数生长期的肝癌Bel-7402细胞，调整细胞浓度为1×10⁵/mL，将其接种到6孔培养板中，每孔500 μL细胞悬液。对照组和华蟾素组(含有IC₅₀的华蟾素)培养4 h后，将细胞暴露于不同剂量X线下进行照射。X线照射条件：直线加速器6 MV X射线，室温条件下垂直照射，照射野面积为15 cm×15 cm，照射源皮距SSD为100 cm，照射剂量为0、2、4、6、8 Gy，机架角180°。照射完毕后弃去细胞培养液，用磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution, PBS)清洗2次，将细胞重悬后接种于60 mm细胞培养皿中，继续培养6 d后，用0.1%结晶紫染色20 min，在低倍显微镜下计数≥50个细胞数的克隆数。依照公式计算集落形成率(plating efficiency, PE)，根据单击多靶模型拟合细胞存活曲线。

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1.2.4　Annexin V/PI荧光双染法检测细胞凋亡

对数生长期的肝癌Bel-7402细胞，以1×10⁵/mL将其接种到6孔培养板中，每孔500 μL，置于37 ℃、5% CO₂培养箱中培养24 h，使细胞同步化，随后将细胞分为4组。(1)对照组：细胞同步后更换为不含华蟾素的培养液培养48 h；(2)华蟾素组：细胞同步后换为含有IC₅₀华蟾素的培养液培养48 h；(3)放疗组：细胞同步后更换为不含华蟾素的培养液培养8 h，然后以筛选出来的6 Gy单次吸收剂量照射，继续培养40 h；(4)联合组：细胞同步后换为含有IC₅₀华蟾素的培养液培养8 h，然后以6 Gy单次吸收剂量照射，继续培养40 h。用0.25%胰蛋白酶消化、PBS清洗、离心收集细胞，用PBS重悬并将细胞浓度调整为1×10⁶/mL；取1 mL细胞悬液至离心管中，4 ℃，离心半径6 cm，1 200 r/min离心5 min，弃上清。加入500 μL Binding Buffer重悬细胞，再加入10 μL Annexin V-FITC和10 μL PI室温避光反应20 min，用流式细胞仪检测细胞凋亡情况，计算细胞凋亡率。

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1.2.5　流式细胞术检测细胞周期

实验分组及处理同1.2.4 。收集细胞浓度调整为1×10⁶/mL。用预冷的75%乙醇，于4 ℃固定过夜。PBS清洗3遍，加入150 μL RNaseA(10 mg/mL)37 ℃水浴30 min，加入50 μL PI，4 ℃避光孵育20 min，用流式细胞仪检测细胞周期分布情况。

1.2.6　Western blot检测p50、p65、Bcl-2、cyclin D1蛋白表达情况

实验分组及处理同1.2.4。用0.25%胰蛋白酶消化，PBS清洗2次后，4 ℃ ，离心半径6 cm，1 000 r/min离心5 min收集细胞，加入300 μL细胞裂解液和3 μL蛋白酶抑制剂，冰上充分裂解后，低温离心取上清。用BCA蛋白浓度检测试剂盒对蛋白浓度进行定量，将各蛋白样品浓度调至统一后与5×SDS PAGE上样缓冲液充分混合，100 ℃煮沸变性5 min，每孔取50 μL加到SDS蛋白凝胶上样孔中进行电泳和转膜，5% BSA封闭2 h。加入一抗(p50单克隆抗体1∶ 500，p65单克隆抗体1∶500，Bcl-2单克隆抗体1∶1 000，cyclinD1单克隆抗体1∶ 1 000)4 ℃过夜，TBST洗膜3次，加入辣根过氧化物标记的二抗(1∶1 500)室温孵育2 h。滴加化学发光剂ECL显色，用蛋白化学发光凝胶成像系统采集图像，以GAPDH为内参，分析蛋白的相对表达量。

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1.3　统计学方法

应用SPSS 22.0统计学软件对实验数据进行分析。服从正态或近似正态分布的计量资料用±s表示，采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2　结果

2.1　华蟾素对肝癌Bel-7402细胞增殖的影响

与对照组相比，0.125、0.250、0.500 、1.000 μg/mL不同浓度华蟾素作用24、48、72 h均抑制肝癌Bel-7402细胞的增殖，差异均有统计学意义(P值均<0.01)；同时，随着华蟾素作用浓度的增加及作用时间的延长，细胞抑制率逐渐升高。华蟾素作用24、48、72 h后的IC₅₀浓度分别为(0.87±0.09)、(0.40±0.04)和(0.23±0.02) μg/mL。见表1。

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表1

对照组及不同剂量的华蟾素组在不同时间对肝癌Bel-7402细胞增殖影响的比较(±s)

表1

对照组及不同剂量的华蟾素组在不同时间对肝癌Bel-7402细胞增殖影响的比较(±s)

组别		样本数	抑制率(%)
组别		样本数	24 h	48 h	72 h
对照组		6	2.12±0.15	2.18±0.16	2.20±0.16
华蟾素组(μg/mL)
	0.125	6	11.46±1.11^a	19.83±1.02^a	31.32±2.23^a
	0.250	6	24.41±2.45^a	42.46±1.65^a	55.77±3.01^a
	0.500	6	45.43±3.12^a	56.74±3.35^a	70.18±4.12^a
	1.000	6	58.86±4.45^a	72.37±4.47^a	85.15±5.11^a
F值			450.754	677.950	564.883
P值			<0.01	<0.01	<0.01

注：与对照组相比，^aP<0.01

2.2　华蟾素对肝癌Bel-7402细胞放疗敏感性的影响

根据MTT检测结果，选择华蟾素作用48 h的IC₅₀ 0.4 μg/mL作为干预剂量，同时以不含华蟾素的培养液作为对照组。随着放射剂量的增加，对照组(单纯照射)细胞存活率逐渐降低，而华蟾素干预组细胞存活率降低更为明显，两组相比差异均有统计学意义(P<0.05)，说明华蟾素能够抑制肝癌Bel-7402细胞照射后的克隆形成能力。见表2。

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表2

对照组和IC₅₀华蟾素组在不同剂量X线照射下肝癌Bel-7402细胞存活率的比较(%，±s)

表2

对照组和IC₅₀华蟾素组在不同剂量X线照射下肝癌Bel-7402细胞存活率的比较(%，±s)

分组	样本数	肝癌Bel-7402细胞存活率
分组	样本数	0 Gy	2 Gy	4 Gy	6 Gy	8 Gy
对照组	6	100	73.5±6.2	39.5±4.0	13.5±1.6	4.2±0.7
IC₅₀华蟾素组	6	53.22±3.11	48.9±3.6	11.3±1.4	32.0±0.6	0.5±0.1
t值			8.405	16.299	14.765	12.817
P值			<0.01	<0.01	<0.01	<0.01

注：IC₅₀华蟾素组为半数抑制浓度为0.4 μg/mL华蟾素组

2.3　华蟾素对肝癌Bel-7402细胞周期比例和细胞凋亡率的影响

与对照组比较，华蟾素组、放疗组及联合组3个处理组肝癌Bel-7402细胞G0/G1期细胞比例均增多、S期细胞比例均减少(P值均<0.05)；除联合组外，其他3组间G2/M期细胞比例未发生明显变化(P>0.05)，联合组G2/M期细胞则低于其他3组(P值均<0.05)；联合组G0/G1期细胞比例均高于华蟾素组与放疗组(P<0.01)，S期细胞比例均低于华蟾素组和放疗组(P<0.01)，差异均有统计学意义(P值均<0.01)。与对照组相比，3个处理组肝癌Bel-7402细胞凋亡率均升高，且联合组细胞凋亡率高于华蟾素组与放疗组，差异均有统计学意义(P值均<0.01)。见表3、图1。

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图1

流式细胞术检测各组肝癌Bel-7402细胞凋亡　1A　对照组　1B　华蟾素组　1C　放疗组　1D　联合组

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流式细胞术检测各组肝癌Bel-7402细胞凋亡　1A　对照组　1B　华蟾素组　1C　放疗组　1D　联合组

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表3

各组肝癌Bel-7402不同周期细胞比例和细胞凋亡检测结果(%，±s)

表3

各组肝癌Bel-7402不同周期细胞比例和细胞凋亡检测结果(%，±s)

组别	样本数	不同周期细胞比例
组别	样本数	G0/G1期	S期	G2/M期	细胞凋亡率(%)
对照组	6	32.59±0.58	43.52±0.98	23.89±0.87	3.08±0.09
华蟾素组	6	48.13±1.06^a	27.82±1.25^a	24.05±1.58	17.69±1.59^a
放疗组	6	46.89±1.66^a	28.16±1.24^a	24.95±1.21	15.67±1.51^b
联合组	6	65.56±1.89^abc	17.29±0.83^abc	17.15±1.19^abc	31.14±1.85^abc
F值		561.633	589.374	50.815	384.432
P值		<0.01	<0.01	<0.01	<0.01

注：与对照组比较，^aP<0.01；与华蟾素组比较，^bP<0.05；与放疗组比较，^cP<0.05

2.4　p50、p65、Bcl-2和cyclin D1蛋白表达水平

肝癌Bel-7402细胞经华蟾素或放疗处理后，Western blot检测细胞中p50、p65、Bcl-2和cyclin D1蛋白表达水平：与对照组相比，华蟾素组、放疗组及联合组肝癌Bel-7402细胞中p50、p65、Bcl-2和cyclin D1蛋白表达水平均降低，联合组比华蟾素组和放疗组下降得更明显，差异均有统计学意义(P值均<0.05)。说明华蟾素可能是通过抑制核因子-κB信号通路及下调Bcl-2和cyclin D1蛋白表达水平，进而增加肝癌Bel-7402细胞的放疗敏感性。见表4和图2。

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图2

不同组肝癌Bel-7402细胞中p50、p65、Bcl-2和cyclin D1蛋白表达电泳图

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图2

不同组肝癌Bel-7402细胞中p50、p65、Bcl-2和cyclin D1蛋白表达电泳图

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表4

各组肝癌Bel-7402细胞中p50、p65、Bcl-2和cyclin D1蛋白表达水平的比较(±s)

表4

各组肝癌Bel-7402细胞中p50、p65、Bcl-2和cyclin D1蛋白表达水平的比较(±s)

组别		样本数	p50	p65	Bcl-2	cyclin D1
对照组		6	0.674±0.062	0.579±0.063	0.787±0.074	0.634±0.062
	华蟾素组	6	0.358±0.042^a	0.244±0.027^a	0.405±0.038^a	0.285±0.034^a
	放疗组	6	0.384±0.038^a	0.283±0.030^a	0.444±0.042^a	0.362±0.041^a
	联合组	6	0.169±0.021^abc	0.141±0.016^abc	0.215±0.023^abc	0.171±0.022^abc
	F值		139.224	144.851	147.795	129.954
P值			<0.01	<0.01	<0.01	<0.01

注：与对照组比较，^aP<0.01；与华蟾素组比较，^bP<0.05；与放疗组比较，^cP<0.05

3　讨论

目前，放疗是恶性肿瘤治疗的重要手段之一，约70%的肿瘤患者，不论是否进行手术，都需要接受放疗^[9]。有研究发现，中药联合放疗可以提高治疗的效果，同时能够降低放疗引起的不良反应^[10]。

华蟾素是从蟾蜍皮中提取出的脂溶性成分，主要生物活性物质是吲哚类生物碱和甾类强心苷，具有抗病毒、抗肿瘤等功效。研究证实，华蟾素能够通过抑制细胞增殖及诱导细胞凋亡等机制抑制多种肿瘤细胞的生长，也有研究发现华蟾素联合放疗可有效提高肿瘤细胞的化疗敏感性^[11,12]。杨兴肖等^[11]研究发现，华蟾素联合放疗能够显著提高对食管癌细胞增殖的抑制作用，并将细胞阻滞于G0/G1期。黄志宇等^[12]研究发现，放疗联合华蟾素治疗可有效提高中晚期非小细胞肺癌的治疗效果，并降低不良反应发生率。本实验中，不同浓度的华蟾素作用于肝癌Bel-7402细胞，结果显示华蟾素能够抑制肝癌细胞的增殖水平，且随着作用浓度的增加及作用时间的延长，细胞抑制率逐渐升高；同时，还发现肝癌Bel-7402细胞用IC₅₀(0.4 μg/mL)华蟾素进行处理，同时将细胞暴露于不同剂量(0、2、4、6、8 Gy)X线下进行照射，细胞存活率低于放疗组(单纯照射)，说明华蟾素能够增强肝癌Bel-7402细胞的放疗敏感性。

研究发现，华蟾素能够使肿瘤细胞阻滞于不同时期：朱晨宇等^[13]报道华蟾素能够抑制直肠癌SW480细胞生长，并将细胞阻滞于G2/M期；黄美华等^[14]报道华蟾素抑制宫颈癌HeLa细胞的生长，并使G0/G1期延长，S期缩短；另外，陶振超等^[15]报道，肝癌细胞经6 MV X射线照射后，细胞周期阻滞在G0/G1期。本研究将结果显示：与对照组相比，3个处理组G0/G1期细胞比例均增多，S期细胞均减少，细胞凋亡率均升高，差异均有统计学意义(P值均<0.05)；说明华蟾素和放疗均能将肝癌Bel-7402细胞周期阻滞于G0/G1期，并诱导细胞凋亡增多，其中与华蟾素组和放疗组相比，联合组细胞周期改变更为显著，细胞凋亡更多。本研究结果与文献报道一致，提示华蟾素联合放疗能够增强对肿瘤细胞的杀伤作用。其作用机制可能是华蟾素能够抑制肿瘤细胞DNA合成，阻滞细胞周期从G0/G1期向S期过渡，从而抑制细胞的增殖，提高肿瘤细胞的放疗敏感性。

Bcl-2基因家族在通过线粒体途径调控细胞凋亡中具有重要的作用，其中Bcl-2是重要的抑制细胞凋亡基因^[16,17,18]。有研究证实，华蟾素可通过影响Bcl-2途径诱导肿瘤细胞凋亡^[19]。cyclin D1是重要的细胞周期调控因子，被认为是一种癌基因，目前研究显示cyclin D1过表达能够造成细胞异常增殖及细胞周期调节失控，华蟾素可通过下调cyclin D1表达抑制多种肿瘤细胞增殖^[20,21]。本研究结果显示，与对照组相比，华蟾素组、放疗组及联合组肝癌Bel-7402细胞中Bcl-2和cyclin D1蛋白表达水平均降低，其中联合组细胞下降更为显著(P<0.01)。说明华蟾素可通过下调Bcl-2和cyclinD1蛋白表达抑制肝癌Bel-7402细胞的凋亡及阻滞细胞周期。

以往研究发现，核因子(NF)-κB信号通路参与细胞的凋亡进程^[22]，肿瘤细胞的凋亡与其放疗敏感性相关。NF-κB活化与放疗增敏的关系是目前研究的热点问题之一。许多研究发现，NF-κB的活性与放疗敏感性呈负相关关系，抑制NF-κB活性能够增强肿瘤细胞的放疗敏感性^[23,24]。本实验结果显示，华蟾素及放疗均能够抑制肝癌Bel-7402细胞中NF-κB信号通路p50和p65蛋白表达，华蟾素与放疗联合组对p50和p65蛋白表达的抑制作用更显著。提示华蟾素可能是通过抑制NF-κB活化，进而增强肝癌Bel-7402细胞的放疗敏感性。

综上所述，本研究发现华蟾素能够增强肝癌Bel-7402细胞的放疗敏感性，其作用机制可能与华蟾素能够通过抑制NF-κB信号通路及下调Bcl-2和cyclin D1蛋白表达，进而抑制细胞增殖、诱导细胞周期阻滞和细胞凋亡相关。本研究仅从华蟾素对肝癌细胞凋亡、周期的影响等方面研究其对肝癌放疗增敏作用，其他的生物学特性以及其他信号通路还有待研究。

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朱琰琰