探讨miR-139-5p对鼻咽癌顺铂(DDP)耐药细胞DDP敏感性的影响及其相关作用机制。
培养鼻咽癌DDP耐药细胞株HNE1/DDP，分为miR-139-5p组、阴性对照组、DDP组和空白对照组，miR-139-5p组转染miR-139-5p类似物，阴性对照组转染阴性对照序列，DDP组和空白对照组不做转染处理。转染后miR-139-5p组、阴性对照组和DDP组均加入20 μmol/L DDP，空白对照组加入培养基，溴化吡啶(PI)单染后流式细胞术检测各组HNE1/DDP细胞凋亡率。采用Western blot检测HNE1/DDP细胞miR-139-5p组、阴性对照组和空白对照组磷酸肌醇3-激酶(PI3K)、磷酸化(p)-PI3K、蛋白激酶B(Akt)、p-Akt及趋化因子受体4(CXCR4)蛋白的相对表达水平。采用实时荧光定量PCR(qPCR)检测miR-139-5p组、阴性对照组和空白对照组CXCR4 mRNA的表达水平。
空白对照组、DDP组、阴性对照组和miR-139-5p组HNE1/DDP细胞凋亡率分别是6.26%±1.19%、22.43%±3.88%、23.87%±3.21%和40.87%±4.04%, DDP组、阴性对照组和miR-139-5p组细胞凋亡率均高于空白对照组，miR-139-5p组细胞凋亡率高于DDP组和阴性对照组，差异均有统计学意义(P值均<0.05)。Western blot检测显示，miR-139-5p组p-Akt、p-PI3K、PI3K及CXCR4蛋白的相对表达量均低于空白对照组和阴性对照组，差异均有统计学意义(P值均<0.01)。实时荧光定量PCR检测结果显示，miR-139-5p组中HNE1/DDP细胞CXCR4的mRNA相对表达水平低于空白对照组和阴性对照组，差异均有统计学意义(P值均<0.01)。
转染miR-139-5p可提高鼻咽癌耐药细胞株HNE1/DDP对DDP的敏感性，其作用机制可能与抑制CXCR4的表达进而调控其下游PI3K/Akt信号通路的活化有关。
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鼻咽癌是我国高发病率的头颈部恶性肿瘤之一，起源于鼻咽的黏膜上皮，并具有高侵袭转移性和隐蔽性强的特点，多数患者确诊时肿瘤已进展为中晚期并伴有淋巴结转移[1]。目前多采用的放疗、化疗联合生物疗法可有效提高鼻咽癌的治愈率，但化疗中出现的细胞耐药，导致恶性肿瘤患者预后较差，出现肿瘤复发和转移，制约了这种疗法的应用[2]。
近年来，微小RNA (micro RNA, miRNA)在肿瘤发生发展及耐药方面的作用越来越受到重视[3]。miRNA是长度18～25个碱基的非编码小RNA，能够通过影响靶基因的转录后调控，进而改变靶蛋白的表达水平。相关研究表明，miRNA影响鼻咽癌等多种肿瘤细胞对化疗药物的敏感性[4,5,6,7]。miR-139-5p是近年发现的对肿瘤增殖、迁移、侵袭起抑制作用的miRNA，在转移性鼻咽癌组织和细胞中表达上调，并对趋化因子受体4(chemokine receptor 4, CXCR4)的表达具有调控作用[8]。CXCR4作为G蛋白偶联受体家族的成员之一，是许多化疗药物的靶标，并在多种类型的人类癌症中过表达[9]。CXCR4在与其配体结合之后，可激活下游胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase 1/2, ERK1/2)或磷酸肌醇3-激酶(phosphatidylinositid 3-kinase, PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号通路，对肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移产生重要影响影响[10]。Hu等[11]提出，CXCR4表达增加可作为癌症进展不良和转移的生物标志物。迄今，在鼻咽癌细胞中，miR-139-5p与CXCR4的相互作用对顺铂(cisplatin, DDP)化疗敏感性的调控机制未见相关的研究报道。
在本研究中，笔者选择人鼻咽癌耐药细胞株HNE1/DDP作为研究对象，通过上调细胞内miR-139-5p的表达水平，检测CXCR4及下游PI3K/Akt信号通路相关蛋白的表达变化，探索miR-139-5p对鼻咽癌耐药细胞DDP敏感性的调控机制，为临床上出现耐药的鼻咽癌患者提供新的治疗线索。
人鼻咽癌DDP耐药细胞株HNE1/DDP均购于中南大学湘雅医学院，冻存培养于蚌埠医学院生化药理实验室。RPMI 1640培养基、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、胰蛋白酶、苯甲基磺酰氟化物(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)，Opti-MEM培养基均购自美国Gibco公司。注射用DDP冻干粉剂由齐鲁制药有限公司生产。脂质体Lipofectamine 2000、Trizol试剂均购自美国Invitrogen公司；增强型化学发光底物(enhanced chemiluminescent, ECL)试剂盒购自美国Pierce公司；溴化吡啶(propiodide, PI)、BCA蛋白定量试剂盒及山羊抗兔IgG辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)购于上海碧云天公司；miR-139-5p类似物和阴性对照购于上海吉玛制药技术有限公司；Primescript® RT reagent Kit反转录试剂盒、SYBR Premix Ex Tap™试剂盒购自大连宝生物工程有限公司。CXCR4和β-actin抗体购自美国Affinity公司；Akt、磷酸化(p)-Akt、PI3K，p-PI3K抗体购自美国CST公司。
从液氮中取出冻存的HNE1/DDP细胞，立即放入37 ℃水浴箱中迅速融化；酒精擦拭冻存管表面，管口过火消毒，用移液枪吸取细胞悬液，转移到无菌离心管中，加入RPMI 1640培养基5 mL，混匀；1 000×g离心5 min，弃上清；5 mL离心管中加入含10%FBS及(1/10的半数抑制浓度)DDP[12]的RPMI 1640培养基，轻轻混匀，移入培养瓶内，置于37 ℃培养箱中培养。培养过程中HNE1/DDP一直使用含DDP的RPMI 1640培养基，以维持细胞的耐药性，至实验前24 h更换为仅含10% FBS的RPMI 1640培养基。
取对数生长期HNE1/DDP细胞接种于6孔板中，分为miR-139-5p组、阴性对照组、DDP组和空白对照组，每组设置3个复孔。各组细胞汇合度达60%～70%时，miR-139-5p组、阴性对照组进行转染：吸去旧培养基，每孔加入1 500 μL Opti-MEM培养基，按照Life Technologies说明书分别将miR-139-5p类似物和阴性对照组序列分别转染入miR-139-5p组和阴性对照组。DDP组和空白对照组加入含10% FBS的RPMI 1640培养基。将4组细胞放入培养箱中继续培养，12 h后更换含10%FBS的RPMI 1640培养基继续培养。miR-139-5p类似物序列：正向引物5′-UCUACAGUGCACGUGUCUCCAGU -3′，反向引物5′-UGGAGACACGUGCACUGUAGAUU-3′。于转染24 h收集细胞进行PI染色实验，转染48 h进行Western blot和实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR, qPCR)。
收集miR-139-5p组、阴性对照组、DDP组和空白对照组细胞。各组调整细胞浓度为1×106/mL接种到12孔板，每组设3个复孔，每孔加1 mL，继续培养24 h至细胞贴壁，miR-139-5p组、阴性对照组和DDP组均加入20 μmol/L DDP 1 mL，空白对照组加入含10%FBS的RPMI 1640培养基1 mL。各组细胞处理后于37 ℃培养箱继续培养24 h，收集细胞于1.5 mL离心管中以2 500×g离心5 min，弃上清液，加入75%乙醇4 ℃固定过夜。次日以1 500×g离心8 min，弃上清，再使用磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution, PBS)洗涤，以2 500×g离心5 min后弃上清，每管加入700 mL PI缓冲液，避光染色3～4 h，使用流式细胞仪检测细胞凋亡率。实验重复3次，结果取平均值。
收集转染48 h后的miR-139-5p组、阴性对照组及空白对照组的HNE1/DDP细胞，置于1.5 mL离心管中，预冷PBS溶液洗涤3次后加入含有PMSF的裂解液，于冰上裂解30 mim后，4 ℃、12 000×g离心30 min，吸取上清液。采用BCA法测定蛋白浓度，用超纯水稀释调整蛋白浓度为4 μg/mL，然后分别与5×溴酚蓝上样缓冲液按4∶1混合，95 ℃煮沸5 min。按每泳道20 μL加入到蛋白凝胶中，70 V电压电泳30 min后，90 V电压电泳至溴酚蓝到达分离胶的底部，终止电泳。50V电压转至聚偏二氟乙烯膜2 h。室温下5%脱脂奶粉封闭2 h后，使用PBS加吐温20(PBS plus tween 20, TPBS)洗涤3次，每次5 min。CXCR4、Akt、p-Akt、PI3K、p-PI3K和β-actin一抗均按1∶1 000比例稀释。聚偏二氟乙烯膜孵育一抗于4 ℃过夜，次日TPBS洗涤3次，每次5 min。二抗(山羊抗兔IgG HRP)1∶2 000稀释，聚偏二氟乙烯膜在二抗中常温下孵育2 h 。使用ECL发光增强液显影，在BIO-RAD凝胶成像系统中曝光获取图像，使用Image J分析软件分析蛋白条带图像灰度值，以β-actin为内参计算各组蛋白的相对表达量，实验重复3次。
收集转染48 h后的miR-139-5p组、阴性对照组和空白对照组HNE1/DDP细胞，置于1.5 mL离心管中，用PBS缓冲液洗涤2次，1 500×g离心5 min，弃上清，加入1 mL Trizol，吹打混匀后转移至无RNA酶的1.5 mL离心管中，冰上放置5 min，使核蛋白复合体完全裂解。加入200 μL氯仿，密封后充分混匀15 s，在冰上放置5 min，4 ℃、12 000×g离心15 min。取上层无色水相转移至无RNA酶离心管中，加入500 μL异丙醇轻轻混匀，冰上静置15 min，4 ℃ 12 000×g离心10 min，弃上清。使用75%乙醇洗涤2次后室温晾干，加入DEPC水溶解后保存于－80 ℃。使用Nano Vue™ Plus分光光度仪检测RNA样品浓度和纯度，每次取RNA样品1 μL，重复检测3次，结果取平均值。各组细胞提取RNA后，按照反转录试剂盒说明合成cDNA，反转录条件为37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。引物由南京金思瑞生物科技有限公司设计并合成，引物序列见表1。qPCR反应体系及条件参照SYBR Premix Ex TapTM试剂盒说明，反应条件为95 ℃ 30 s、95℃ 5 s、58℃ 30 s，40个循环。使用GAPDH作为内参，根据qPCR反应曲线得出阈值循环参数后使用计算机分析荧光阈值(cycle threshold, Ct)。按照2－ΔΔCt法计算出各组目的基因的相对表达量。
目的基因引物名称、序列和产物长度
目的基因引物名称、序列和产物长度
| 引物名称 | 引物序列 | 产物长度 |
|---|---|---|
| CXCR4 | 正向引物：5′-GAACCCTGTTTCCGTGAAGA-3′ | 150 bp |
| 反向引物：5′-CTTGTCCGTCATGCTTCTCA-3′ | ||
| GAPDH | 正向引物：5′-CAGCCTCAAGATCATCAGCA-3′ | 106 bp |
| 反向引物：5′-TGTGGTCATGAGTCCTTCCA-3′ |
应用SPSS 15.0软件分析实验数据。服从或近似服从正态分布的计量资料以
±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
流式细胞术检测结果显示，空白对照组、DDP组、阴性对照组和miR-139-5p组细胞凋亡率分别是6.26%±1.19%、22.43%±3.88%、23.87%±3.21%和40.87%±4.04%，组间差异有统计学意义(F＝18.580, P﹤0.05)；DDP组、阴性对照组和miR-139-5p组细胞凋亡率均高于空白对照组，miR-139-5p组细胞凋亡率高于DDP组和阴性对照组，差异均有统计学意义(P值均<0.05)。结果提示，转染后鼻咽癌耐药细胞HNE1/DDP细胞对DDP的敏感性明显增加。见图1。
结果显示，miR-139-5p组p-Akt、p-PI3K、PI3K、CXCR4蛋白的相对表达量均明显低于空白对照组和阴性对照组，差异均有统计学意义(P值均<0.01)；Akt蛋白的相对表达量3组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2、图2。
各组HNE1/DDP细胞中p-Akt、Akt、p-PI3K、PI3K蛋白相对表达量的比较(
±s)
各组HNE1/DDP细胞中p-Akt、Akt、p-PI3K、PI3K蛋白相对表达量的比较(±s)
| 组别 | 样本数 | p-Akt | Akt | p-PI3K | PI3K |
|---|---|---|---|---|---|
| 空白对照组 | 3 | 1.28±0.11 | 1.49±0.11 | 0.55±0.04 | 1.01±0.06 |
| 阴性对照组 | 3 | 1.35±0.16 | 1.60±0.22 | 0.61±0.07 | 1.09±0.11 |
| miR-139-5p组 | 3 | 0.40±0.02ab | 1.60±0.12 | 0.12±0.02ab | 0.22±0.04ab |
| F值 | 22.650 | 0.133 | 32.246 | 37.307 | |
| P值 | <0.01 | >0.05 | <0.01 | <0.01 |
注：与空白对照组相比，aP<0.01；与阴性对照组相比，bP<0.01。
结果显示，miR-139-5p组中CXCR4的mRNA相对表达水平明显低于空白对照组和阴性对照组，差异均有统计学意义(P值均﹤0.01)。见表3。
HNE1/DDP细胞中各组CXCR4蛋白和mRNA相对表达水平的比较(
±s)
HNE1/DDP细胞中各组CXCR4蛋白和mRNA相对表达水平的比较(±s)
| 组别 | 样本数 | CXCR4蛋白 | CXCR4 mRNA |
|---|---|---|---|
| 空白对照组 | 3 | 1.32±0.06 | 1.03±0.08 |
| 阴性对照组 | 3 | 1.26±0.01 | 1.06±0.07 |
| miR-139-5p组 | 3 | 0.04±0.02ab | 0.15±0.01ab |
| F值 | 78.700 | 69.622 | |
| P值 | ﹤0.01 | ﹤0.01 |
注：与空白对照组相比，aP﹤0.01；与阴性对照组相比，bP﹤0.01
miRNA是高度非编码的小RNA分子，结合相应靶mRNA的3′非编码区以调节靶基因。近年来研究证明，miRNA可以作为致癌物或肿瘤抑制基因，对肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移能力具有调控作用[13,14]，如miR-98[15]、miR-10b[16]和miR-212[17]等多种miRNA均被证明可以通过调控相应靶基因的表达影响鼻咽癌细胞的侵袭转移能力。异常表达的miRNA可能对肿瘤细胞的化疗耐药性具有调控作用[18]，这为研究肿瘤细胞耐药的机制的提供了新的思路和启示。
miR-139-5p经证实是与多种癌症复发和转移相关的肿瘤抑制因子[19]，在鼻咽癌等多种转移性肿瘤中表达下调[20]。本研究结果显示，过表达miR-139-5p能够增强HNE1/DDP细胞对化疗药物DDP的敏感性、增加细胞凋亡率，从而证实，miR-139-5p在鼻咽癌细胞中的表达对于增强细胞的DDP敏感性、逆转DDP耐药起到了重要影响作用。
PI3K/Akt信号通路是与肿瘤细胞的增殖、迁移密切相关的重要的细胞通路，该信号通路失去活性能抑制肿瘤细胞的侵袭、迁移能力及对化疗药物的敏感性[21]。在本研究中，转染miR-139-5p类似物后，通过检测HNE1/DDP细胞中CXCR4下游关键因子Akt、PI3K的磷酸化水平，观察miR-139-5p对CXCR4及下游PI3K/Akt信号通路活化的调控作用，结果显示，CXCR4的蛋白和mRNA表达水平及磷酸化PI3K蛋白在HNE1/DDP细胞中的表达水平在上调miR-139-5p表达后显著降低，其下游Akt的活化受到抑制。CXCR4表达增加可作为鼻咽癌等多种癌症转移和预后不良的生物标志物，并且已被证明是许多化疗药物的药理学靶标[22]。因此笔者推测，miR-139-5p可能通过抑制CXCR4的表达调控PI3K/Akt信号通路的激活，从而降低鼻咽癌DDP耐药细胞的耐药性。
综上，本研究结果证明miR-139-5p可通过下调CXCR4的表达，降低下游信号通路蛋白Akt、PI3K的磷酸化水平，从而调控鼻咽癌DDP耐药细胞的DDP敏感性，实现耐药细胞一定程度上的逆转耐药。这为临床上由于DDP化疗耐药而影响治疗和预后的鼻咽癌患者提供了一个潜在的新的治疗靶点。由于本研究只在一组鼻咽癌耐药细胞中进行体外实验，存在一定局限性，后续将在多种鼻咽癌细胞及体内实验中深入研究其耐药相关机制。
