探讨Xklp2靶蛋白(TPX2)对人肺癌细胞增殖、凋亡及活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cleaved caspase-3)表达影响。
培养人肺癌细胞A549，分为Control组(不进行细胞转染)、siRNA-NC组(细胞转染TPX2 siRNA control)、TPX2 siRNA组(细胞转染TPX2 siRNA)，采用实时荧光定量PCR (qPCR)和Western blot检测TPX2 siRNA的转染效果。取转染后各组细胞，采用噻唑蓝检测细胞增殖情况，流式细胞术检测细胞凋亡情况，Western blot检测cleaved caspase-3蛋白表达情况。
TPX2 siRNA组中，TPX2 mRNA、蛋白水平和细胞光密度(OD)值均明显低于Control组和siRNA-NC组，细胞凋亡率、细胞中cleaved caspase-3蛋白表达水平均明显高于Control组和siRNA-NC组，差异均有统计学意义(P值均<0.05)；而siRNA-NC组中，TPX2 mRNA、蛋白水平及细胞OD值、细胞凋亡率、细胞中cleaved caspase-3与Control组比较，差异均无统计学意义(P值均>0.05)。
TPX2 siRNA能够干扰人肺癌细胞A549中TPX2的表达。下调TPX2的表达能够抑制人肺癌细胞A549增殖，促进caspase-3活化，促进人肺癌细胞A549的凋亡。
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肺癌是一种严重危害人类生命健康的恶性肿瘤，其发病率及死亡率呈现逐年上升的趋势[1]。研究表明，在全部恶性肿瘤中，肺癌在男性人群中的发病率及病死率均居第1位，而在女性中的发病率及病死率均居第2位[2,3]。肺癌的发病机制极其复杂，并且具有早期发病症状不明显、发展速度快、易转移等特点，这给肺癌的诊治带来了巨大挑战[4]。Xklp2靶蛋白(targeting protein for Xklp2, TPX2)是一种微管相关蛋白，能够调控纺锤体的形成，与细胞的有丝分裂有关[5]。研究表明，TPX2在胰腺癌、宫颈癌、乳腺癌、肺癌等多种癌症组织中过表达，这与癌细胞的生长、凋亡等有关[6,7,8,9]。目前，对于TPX2在肺癌细胞增殖、凋亡中的作用研究较少，本研究以肺癌细胞为研究对象，通过小干扰RNA技术探讨TPX2在人肺癌细胞增殖、凋亡中的作用，以期为靶向治疗肺癌提供新思路。
人源非小细胞肺癌细胞A549购自美国模式菌种收集中心。牛血清白蛋白购于美国Sigma公司；胰蛋白酶、胎牛血清、RPMI 1640培养液均购自美国Gibco公司；兔抗TPX2多克隆抗体、兔抗活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase 3, cleaved caspase-3)多克隆抗体购自美国Abnova公司；兔抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)多克隆抗体、羊抗兔辣根过氧化物酶标记的二抗均购自美国BD公司；TPX2小干扰RNA(TPX2 siRNA)、小干扰RNA阴性对照(siRNA control)均购自美国Abbexa公司；TPX2、GAPDH引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；Lipofectamine 2000购自美国Thermo公司；二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白浓度检测试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司。
将保存在液氮罐中的A549细胞取出，37 ℃融化，用含10%胎牛血清的RPMI 1640细胞培养液悬浮，种植于细胞培养瓶，在37 ℃、5% CO2饱和湿度的培养箱中培养。观察细胞融合>90%时，弃培养液，加入0.25%胰蛋白酶在37 ℃培养箱中反应2 min，1 000×g离心10 min，吸除上清，用5 mL的RPMI 1640细胞培养液悬浮，接种到2个细胞瓶中继续培养。
将A549细胞调整浓度为2×104/mL的细胞悬浮液，以4×104/孔细胞接种到6孔细胞培养板中，分为Control组、siRNA-NC组、TPX2 siRNA组，每组设置3个复孔。在37 ℃、5% CO2培养箱中培养到细胞融合度>70%时进行细胞转染。按照Lipofectamine 2000转染试剂说明将TPX2 siRNA、siRNA control分别转染到TPX2 siRNA组、siRNA-NC组；Control组不进行细胞转染，正常培养，不予特殊处理。siRNA正向引物5’-GUGCCUGUAUCUCCCAAAUTT-3’，反向引物5’-AUUUGGGAGAUACAGGCACTT-3’。各组细胞在转染后分别采用实时荧光定量PCR (quantitative real-time PCR，qPCR)和Western blot检测细胞中TPX2 mRNA和蛋白水平。
Control组及siRNA-NC组、TPX2 siRNA组细胞转染后继续在37 ℃、5% CO2饱和湿度的培养箱中培养48 h，用RNA提取试剂盒提取各组细胞中的RNA，－80 ℃保存，用紫外分光光度计检测RNA的浓度。各组提取RNA后，根据cDNA合成试剂盒合成cDNA，反转录条件：42 ℃孵育60 min，70 ℃孵育15 min。qPCR检测试剂盒检测目的基因转录水平，采用SYBR荧光染料，目的基因序列及产物长度见表1。qPCR反应条件为：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40个循环。以GAPDH为内参基因，根据qPCR反应曲线得出阈值循环参数，用计算机分析荧光阈值(cycle threshold, Ct)。取内参基因和目的基因的Ct均值，计算出Control组、siRNA-NC组、TPX2 siRNA组的ΔCt，采用2－ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。
目的基因引物名称、序列及产物长度
目的基因引物名称、序列及产物长度
| 引物名称 | 引物序列 | 产物长度 |
|---|---|---|
| TPX2 | 正向引物：5’-ACCTTGCCCTACTAAGATT-3’ | 332 bp |
| 反向引物：5’-AATGTGGCACAGGTTGAGC-3’ | ||
| GAPDH | 正向引物：5’-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3’ | 247 bp |
| 反向引物：5’-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3’ |
注：TPX2为Xklp2靶蛋白；GAPDH为兔抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶
Control组、siRNA-NC组、TPX2 siRNA组细胞转染后，在37 ℃、5% CO2饱和湿度的培养箱中培养48 h，按照蛋白提取试剂盒提取细胞中的总蛋白。每组取100 μg蛋白样品，加入1∶1体积的2×Loading buffer煮沸5 min。按照每孔加入50 μg上样，90 V电压电泳，观察溴酚蓝进入分离胶和浓缩胶交界处后，120 V电压电泳至结束。应用硝酸纤维素膜以200 mA电流转膜90 min。转膜后的硝酸纤维素膜室温下5%牛血清白蛋白中封闭60 min。硝酸纤维素膜再用PBS加Tween 20(PBS plus Tween 20, PBST)漂洗5 min，3次。漂洗后的硝酸纤维素膜加入兔抗TPX2一抗(1∶1 000)、兔抗cleaved caspase-3一抗(1∶1 000)、兔抗GAPDH一抗(1∶2 000)在4 ℃孵育过夜。次日用PBST漂洗5 min，3次。然后分别与羊抗兔辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶2 000)室温下孵育60 min。ECL化学发光液显色。美国Bio-Rad伯乐GelDocXR＋凝胶成像分析系统拍照，Quantity-One软件分析目的蛋白表达水平。以GAPDH为内参计算各组蛋白的相对表达量。目的蛋白的相对表达量＝目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值。
Control组、siRNA-NC组、TPX2 siRNA组细胞转染后，在37 ℃、5% CO2饱和湿度的培养箱中培养到细胞呈对数期生长，用胰蛋白酶消化后，1 000×g离心10 min，弃上清液，用细胞培养液调整细胞浓度为2×104/mL，以2×103/孔细胞接种到96孔板中；同时设置空白组(仅加入细胞培养液)，用于调零。每组设置8个复孔。各组细胞培养48 h后，每孔加20 μL浓度为5 mg/mL噻唑蓝，37 ℃孵育4 h，终止培养。将上清液吸除后，每孔加二甲基亚砜溶液150 μL，震荡10 min，用全自动定量绘图酶标仪检测490 nm光密度(optical density, OD)值，间接反映活细胞数量。实验重复3次，结果取平均值。
Control组、siRNA-NC组、TPX2 siRNA组细胞转染后在37 ℃、5% CO2饱和湿度的培养箱中继续培养48 h，吸除细胞培养液，用冰预冷PBS洗涤细胞2次，加入0.25胰蛋白酶消化1 min，转移消化液至离心管中，1 000×g离心10 min，弃上清液。加入细胞培养液，调整细胞浓度为106/mL。吸取1 mL的细胞悬浮液，1 000×g离心10 min，弃上清液。加200 μL Binding Buffer、10 μL Annexin V-FITC和10 μL PI，轻轻混匀，避光室温反应15 min或4 ℃反应30 min。再加入300 μL Binding Buffer，用流式细胞仪检测细胞凋亡率。实验重复3次，结果取平均值。细胞凋亡率(%)＝细胞凋亡数目/细胞总数×100%。
采用SPSS 22.0统计学软件分析。服从正态分布的计量资料以
±s表示，采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
TPX2 siRNA组中，TPX2 mRNA和蛋白水平均明显低于Control组和siRNA-NC组，差异均有统计学意义(P值均<0.05)；而siRNA-NC组中，TPX2 mRNA和蛋白水平与Control组比较，差异均无统计学意义(P值均>0.05)。结果提示，TPX2 siRNA能干扰肺癌细胞中TPX2的表达。见图1和表2。
注：TPX2为Xklp2靶蛋白；GAPDH为兔抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶
转染后各组细胞中TPX2 mRNA和蛋白的表达水平比较(
±s)
转染后各组细胞中TPX2 mRNA和蛋白的表达水平比较(±s)
| 组别 | 样本数 | mRNA | 蛋白表达 |
|---|---|---|---|
| Control组 | 3 | 1.01±0.12 | 1.36±0.12 |
| siRNA-NC组 | 3 | 0.97±0.13 | 1.34±0.15 |
| TPX2 siRNA组 | 3 | 0.35±0.04ab | 0.43±0.05ab |
| F值 | 37.459 | 64.470 | |
| P值 | <0.01 | <0.01 |
注：TPX2为Xklp2靶蛋白；与Control组相比，aP<0.05；与siRNA-NC组比较，bP<0.05
siRNA-NC组细胞OD值与Control组相比差异无统计学意义(P>0.05)；而TPX2 siRNA组细胞OD值明显低于Control组和siRNA-NC组，差异均有统计学意义(P值均<0.05)。结果提示，干扰TPX2表达能够抑制肺癌细胞的增殖。见表3。
转染后各组细胞光密度值比较(
±s)
转染后各组细胞光密度值比较(±s)
| 组别 | 样本数 | OD值 |
|---|---|---|
| Control组 | 3 | 0.96±0.10 |
| siRNA-NC组 | 3 | 0.97±0.08 |
| TPX2 siRNA组 | 3 | 0.72±0.06ab |
| F值 | 9.015 | |
| P值 | <0.05 |
注：TPX2为Xklp2靶蛋白；OD为光密度；与Control组相比，aP<0.05；与siRNA-NC组比较，bP<0.05
TPX2 siRNA组细胞凋亡率明显高于Control组和siRNA-NC组，差异均有统计学意义(P值均<0.05)；而siRNA-NC组细胞凋亡率与Control组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。结果提示，TPX2 siRNA能够促进肺癌细胞凋亡。见图2和表4。
转染后各组细胞凋亡率比较(%，
±s)
转染后各组细胞凋亡率比较(%，±s)
| 组别 | 样本数 | 细胞凋亡率 |
|---|---|---|
| Control组 | 3 | 8.25±0.75 |
| siRNA-NC组 | 3 | 8.64±0.93b |
| TPX2 siRNA组 | 3 | 24.36±1.98ab |
| F值 | 142.153 | |
| P值 | <0.05 |
注：TPX2为Xklp2靶蛋白；与Control组相比，aP<0.05；与siRNA-NC组比较，bP<0.05
TPX2 siRNA组cleaved caspase-3蛋白的表达明显高于Control组和siRNA-NC组，差异均有统计学意义(P值均<0.05)；siRNA-NC组cleaved caspase-3蛋白的表达与Control组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。结果提示，TPX2 siRNA能够促进肺癌细胞中cleaved caspase-3的表达，促进肺癌细胞凋亡。见图3和表5。
注：TPX2为Xklp2靶蛋白；GAPDH为兔抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶
cleaved caspase-3蛋白的表达比较(
±s)
cleaved caspase-3蛋白的表达比较(±s)
| 组别 | 样本数 | cleaved caspase-3 |
|---|---|---|
| Control组 | 3 | 0.32±0.04 |
| siRNA-NC组 | 3 | 0.34±0.05 |
| TPX2 siRNA组 | 3 | 0.69±0.07ab |
| F值 | 43.300 | |
| P值 | <0.05 |
注：TPX2为Xklp2靶蛋白；与Control组相比，aP<0.05；与siRNA-NC组比较，bP<0.05
TPX2在有丝分裂过程中被磷酸化，形成以微管依赖的方式存在的微管蛋白，其大小为82.4 kDa，在细胞有丝分裂过程中发挥调控作用[10]。TPX2能够促进DNA异倍体、多倍体等形成，并且能够抑制正常组织中的核分裂，阻碍其发生的自身激活途径[11]。研究显示，TPX2参与纺锤体的组装、染色体的分离等过程，在大鼠肾脏细胞的生长过程中发挥调控作用[12]。在肿瘤组织中，TPX2癌基因能够诱导HeLa细胞发生有丝分裂胁迫，导致有丝分裂调控过程发生紊乱[13]。有研究表明，食管鳞状细胞癌中，下调肿瘤细胞中TPX2的表达后，能诱导肿瘤细胞凋亡，阻碍肿瘤细胞的增殖[14]。干扰肝癌细胞中TPX2表达后，能够抑制癌细胞的生长[15]。林冬梅等[16]的研究表明，TPX2在肺癌组织中的表达水平明显高于正常组织，并且与肺癌的分期、淋巴结转移等有关。本研究结果显示，干扰TPX2表达后的人肺癌细胞生长受到抑制，凋亡增多；这说明，下调TPX2能够抑制人肺癌细胞的增殖，促进人肺癌细胞凋亡。
细胞凋亡是一个极为复杂的过程，受到多种基因严格调控，是细胞维持内环境稳定的重要方式。caspase是目前研究的较多的与细胞凋亡有关的蛋白酶家族，存在于细胞质中，其激活后能够促进细胞凋亡的发生。人类caspase成员较多，已经发现有11个成员，根据其作用不同可以分为凋亡起始因子和凋亡执行因子，其中caspase-3是凋亡执行因子[17]。正常情况下，caspase-3以酶原的形式存在，在受到外界刺激后，可以活化形成cleaved caspase-3，cleaved caspase-3是细胞凋亡进入不可逆阶段的标志[18]。本研究结果显示，下调TPX2后细胞中cleaved caspase-3表达水平升高，提示下调TPX2能够通过促进cleaved caspase-3表达诱导肺癌细胞凋亡。
综上所述，下调TPX2能够抑制肺癌细胞增殖，促进肺癌细胞中cleaved caspase-3表达，促进肺癌细胞凋亡。本研究为靶向TPX2治疗肺癌提供了理论依据，为进一步探讨TPX2在肺癌中的作用机制奠定了基础。本研究不足之处在于只选用人肺癌细胞A549在体外进行了细胞试验。在今后的研究中拟选用多种肺癌细胞进行进一步实验观察，并对其相关作用机制进行深入探讨。
