运用3D打印技术制备新型羟基磷灰石/二氧化锆(HA/ZrO2)梯度复合材料，分析其性能，并观察其修复比格犬股骨干骨缺损的能力。
随机抽取6月龄雄性比格犬1只，截去右下肢股骨中段全层15 mm制成骨缺损模型后，放入动物专用Micro CT进行容积扫描，完成数据采集、转化及后期处理，将处理后的数据导入CeraFab 7500光固化3D打印机中。根据设定参数启动打印程序，形成复合光敏树脂初胚，并对其进一步脱脂烧结，然后采用浸涂法制备HA/ZrO2梯度复合材料。运用扫描电镜、X射线衍射(XRD)和生物力学实验分析HA/ZrO2梯度复合材料的性能。制备HA/ZrO2梯度复合材料浸提液。培养小鼠成纤维细胞株L929，采用噻唑蓝(MTT)法检测HA/ZrO2梯度复合材料对体外细胞增殖和毒性的影响。将16只比格犬随机分为4组，每组4只。A组：截取犬股骨中段15 mm后，不植入任何材料；B组、C组、D组分别截去股骨中段15、25、35 mm制成骨缺损模型，然后分别植入相应规格的HA/ZrO2梯度复合材料。术后第2、4、8、12周拍摄术肢股骨正侧位X片，观察植入材料与自身骨结合情况及周围骨痂生长情况。术后12周处死实验动物，截取整段股骨，大体观察标本植入材料与周围骨生长状况；行Micro CT扫描，测定新生骨量，并对新生骨进行3D图像重建；对股骨标本进行极限抗压实验，测量极限抗压强度。
运用3D打印技术制备的HA/ZrO2梯度复合材料扫描电镜显示表面光滑，结构均匀，断口表面层均匀过渡结合，没有明显界限，相互之间冶金结合，结构稳定。XRD分析显示HA及ZrO2峰形明显、结晶程度较好、粉体纯度高。抗压试验显示极限抗压强度为(43.37±2.31) MPa。MTT试验显示HA/ZrO2梯度复合材料无明显细胞毒性。实验动物术后X线片显示：A组术后形成骨不连；B组有连续性骨痂通过，人工假体与宿主骨之间的界线消失；C组术后第2、4、8周连续性骨痂及新生骨长入速度较B组缓慢，但人工假体与断端间隙逐渐被新生骨填充，有连续性骨痂通过；D组新骨生成缓慢，仅在断端周围出现新生骨。术后12周取材，Micro CT 3D重建及新生骨量检测，B、C、D组单位体积新生骨量分别为(238.55±19.11) mm3/cm3、(223.31±13.41) mm3/cm3、(110.83±6.48) mm3/cm3，3组间比较差异有统计学意义(F＝156.824，P<0.01)，其中B、C组新生骨量明显多于D组，差异均有统计学意义(P值均<0.05)。新生骨CT 3D重建显示：B组复合材料整体被新生骨包绕，无外露；C组复合材料少许外露，表面基本被新生骨填塞；D组复合材料大部外露，新生骨散在长入。B、C、D组股骨标本极限抗压强度分别为(49.72±2.33) MPa、(49.81±2.43) MPa、(46.92±3.61) MPa，3组间比较差异无统计学意义(F＝1.119，P>0.05)。
运用3D打印技术制备的纳米HA/ZrO2梯度复合材料具有可靠的生物相容性及生物力学强度，可以实现临床个体化治疗原则，能很好地修复犬股骨干35 mm内骨缺损，是一种理想的骨组织替换材料。
版权归中华医学会所有。
未经授权，不得转载、摘编本刊文章，不得使用本刊的版式设计。
除非特别声明，本刊刊出的所有文章不代表中华医学会和本刊编委会的观点。
创伤造成的大段骨缺损的治疗一直是骨科领域的难题。四肢长骨的大段骨缺损不但需要的植骨量大，还对术后的力学性能有很高的要求[1]。骨组织工程学技术的发展虽为骨缺损修复治疗注入了新的活力，但对骨大段缺损的治疗仍有其不足之处；因此，提高生物材料自身力学性能、成品模式化、促进生物材料在体内成骨及血管化效能等逐渐成为研究的新趋势和热点[2]。
为解决理想的骨组织工程支架材料的难题，笔者所在团队前期研究已采用干铺-烧结的方法研制了羟基磷灰石(hydroxyapatite, HA)/二氧化锆(zirconium oxide, ZrO2)梯度复合物(HA/ZrO2)，并经实验证明了该材料生物相容性、免疫相容性、成骨效能及力学性能良好，且无基因毒性，能够与骨界面形成良好的生物连接，是一种能够运用于临床的新型的骨缺损修复材料[3,4,5,6,7,8]。但实验中干铺-烧结法制造材料耗时较长，操作不便，且每次制备的HA/ZrO2复合材料孔隙率不可控制，存在100 μm左右的浮动范围。同时该方法制备需要固定模具，成品样式固定，不能满足临床复杂骨缺损的要求；因此，需要一种新的方式来改进制备工艺并实现生物材料治疗的个体化需求。
3D打印成形技术是一项新型的快速成型技术。将3D打印成形技术与CT、MRI扫描数据的3D重构技术相结合，通过反求技术，从外形仿生可以实现患者缺损部位假体填充的个性化制作[9]。近年来，研究较多的是利用快速成型技术打印3D支架材料，采用该方法在制造仿生骨骼大体外形和微细结构方面，有着其他传统工艺不可比拟的优势，可以制作出适合细胞生长的孔隙结构，并可实现孔隙之间完全贯通及孔隙梯度结构的成形，因此可以直接制作出骨骼内部的仿生微结构[10,11]。
本实验运用光敏树脂选择性固化成型3D打印技术个体化制备具有良好生物相容性和充分力学强度的新型HA/ZrO2梯度复合材料，植入比格犬股骨干缺损部位，研究其骨修复能力，为临床大段骨缺损的治疗提供实验依据。
成年雄性比格犬17只，犬龄6个月，体质量8～10 kg，清洁级，购于浙江中医药大学动物实验中心[动物使用许可证号：SYXK(浙)2013-0304]。实验过程中，按照国家科学技术部发布的《关于善待实验动物旳指导性意见》饲养、处置动物。
实验小鼠成纤维细胞株L929购于中科院上海细胞所细胞库。RPMI 1640完全培养液、青霉素-链霉素双抗购于吉诺生物医药技术有限公司，细胞基础培养基(Dulbecco's modified eagle medium, DMEM)购于美国Gibco公司，胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)购于杭州四季清生物技术有限公司，噻唑蓝(methyl thiazoly tetrazolium, MTT)购于北京索莱宝科技有限公司，二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)、乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid, EDTA)购于美国Sigma公司，戊巴比妥钠购于北京化学试剂公司，注射用青霉素钠购于华北制药股份有限公司。
扫描电子显微镜(日本Hitachi公司)，光固化3D打印机(奥地利Lithoz公司)，C形臂X线机(日本Toshiba公司)，Micro CT(比利时Bruker公司)，RINT2000 X射线衍射(X-ray Diffraction, XRD)分析仪(日本Rigaku公司)，CMT5105微机控制电子万能材料实验机(美国Instron公司)，－30 ℃冰箱(美国Puffhubbard公司)。
随机抽取6月龄雄性比格犬1只，术前12 h禁食，3%戊巴比妥钠按1 mL/kg剂量静脉麻醉，气管插管。取右下肢股外侧正中切口约8 cm，逐层切开皮肤、皮下组织，从肌肉间筋膜间隙钝性分离，暴露股骨，测量长度后，根据犬股骨干骨缺损临界值15 mm[12]，截去股骨中段全层(包括骨膜)15 mm，制成骨缺损模型，然后行有限接触钢板内固定。C形臂X线机下透视见螺钉长度合适，钢板固定稳妥。用生理盐水反复冲洗，逐层缝合关闭切口。术后常规饲养，并予青霉素钠160万U肌内注射，每日1次，持续3 d。
术后即刻将股骨干骨缺损模型犬放入动物专用Micro CT，进行容积扫描。扫描参数：电压90 kV，电流278 μA，扫面层厚34.92 μm。图像数据传至图形工作站，以DICOM数据格式输出。
将Micro CT已输出的DICOM数据通过MAGICS软件进行转化，具体操作如下：将比格犬股骨干中段CT医学图像源3D数据按原始尺寸导入MAGICS软件，设置图片坐标，使用剖面线工具测量出该部位的密度分布，使用区域增长命令阈值(thresh holding)，对其所在密度范围进行选取，过滤出骨骼组织。生成的股骨横切面有时会形成空洞，通过调节阈值范围或者编辑蒙板工具进行编辑、修补。经过修补后，对股骨干所在灰度值进行3D重建，导出3D打印所用的STL文件。根据所需复合材料的孔隙率要求，对STL格式文件进一步地处理。调取图像，取犬股骨干中段平均直径，包括外圈直径14 mm，内圈直径8 mm。拉伸中空圆柱，长度设计为15 cm，沿长度方向阵列，作样条曲线，再画一个球切除实体，沿旋转阵列，用半球实体切割上平面，采用填充阵列。圆柱切割贯通整个实体，圆柱相交为90°，再延长度进行阵列。保存修改结果，导出STL文件。
由于犬股骨干中段约50 mm范围内其管径及骨质厚度基本相似，依据15 mm骨缺损模型的数据在3D处理软件中进行拉伸，形成25 mm及35 mm骨缺损模型，同样进行上述数据采集、数据转化及后期处理，保存结果，导出相应STL文件。
将犬股骨干CT扫描数据转化为STL文件并进一步加工处理后，导入至光固化3D打印机中。设置平面分辨率为40 μm(635 dpi)，像素1 920×1 080，工作台大小76 mm×43 mm×150 mm，层厚25 μm，曝光时间为1 s，开始打印层厚参数设置为10 μm。配制纳米级ZrO2泥浆，加入光敏树脂，使ZrO2与树脂质量比为15%，导入料桶。根据设定参数启动打印程序，通过发光二级管(light emitting diode, LED)紫外光源使树脂引起聚合反应，材料逐层固化成型，形成复合光敏树脂初胚。初胚形成后，对其同时行脱脂烧结处理。具体步骤如下：(1)烘干及挥发阶段，从25 ℃至500 ℃；(2)脱脂及高温烧结阶段，从500 ℃至1 450 ℃；(3)冷却阶段，达到1 450℃的最高烧结温度后，保温2 h，冷却至25 ℃。整个脱脂烧结过程共耗时120.5 h。各阶段升温时间、升温速度及保温时间见表1。
ZrO2脱脂烧结各阶段温度、时间、速率及保温时间
ZrO2脱脂烧结各阶段温度、时间、速率及保温时间
| 脱脂烧结 | 保持温度(℃) | 升温时间(h) | 升温速度(K/min) | 保温时间(h) |
|---|---|---|---|---|
| T0 | 25 | |||
| T1 | 75 | 4.0 | 0.208 | 6.0 |
| T2 | 170 | 6.0 | 0.264 | 8.0 |
| T3 | 200 | 4.0 | 0.125 | 6.0 |
| T4 | 330 | 14.0 | 0.155 | 6.0 |
| T5 | 380 | 6.0 | 0.139 | 6.0 |
| T6 | 500 | 8.0 | 0.250 | 0.0 |
| T7 | 1 250 | 7.5 | 1.677 | 0.0 |
| T8 | 1 450 | 1.0 | 3.333 | 2.0 |
| T9 | 25 | 36.0 | －0.660 | 0.0 |
注：T0为ZrO2材料初始温度；T1为ZrO2材料从初始温度烧结至75 ℃及保温6 h阶段；T2为ZrO2材料从75 ℃烧结至170 ℃及保温8 h阶段；T3为ZrO2材料从170 ℃烧结至200 ℃及保温6 h阶段；T4为ZrO2材料从200 ℃烧结至330 ℃及保温6 h阶段；T5为ZrO2材料从330 ℃烧结至380 ℃及保温6 h阶段；T6为ZrO2材料从380 ℃烧结至500 ℃阶段；T7为ZrO2材料从500 ℃烧结至1 250 ℃阶段；T8为ZrO2材料从1 250 ℃烧结至1 450 ℃及保温2 h阶段；T9为ZrO2材料从1 450 ℃降温至25 ℃阶段
采取浸涂法制备HA/ZrO2梯度复合材料。第一层浆料配比：31.1%纳米级ZrO2粉末31.1 g，13.3%纳米级HA粉末13.3 g，53%双蒸水53 mL，1.4%磷酸乙酯1.4 g，0.2%乙基纤维素0.2 g。HA加热至800 ℃后保温2 h，备用，双蒸水加热至50 ℃，将上述材料混合导入双蒸水中，充分搅拌。将光固化成型的纯ZrO2陶瓷浸入浆料中使其充分渗透，取出，甩去多余浆料。100 ℃电炉中烘干2 h，再加热到900 ℃，保温5 h，最后加热到1 250℃，保温1 h。第二层浆料配比：3.9%纳米级ZrO2粉末3.9 g，35.5%纳米级HA粉末35.5 g，58%双蒸水58 mL，1.4%磷酸乙酯1.4 g与0.2%乙基纤维素0.2 g。重复上述步骤。冷却后得到HA/ZrO2梯度复合材料。
取HA/ZrO2梯度复合材料颗粒，用导电胶固定于样品台上，用真空离子溅射仪表面溅射喷金，扫描电镜观察颗粒表面3D结构，逐倍放大对焦，调节清晰对比度，选择合适倍数扫描照片。
将材料研磨成粉末状，325目筛网过滤筛选，取粉末均匀铺于载玻片上，平铺时粉末要求无颗粒感。打开XRD测试仪，将样本置于卡槽中，打开软件设置参数，使X线管电压40 kV，管电流40 mA，扫描速度为2°/min，衍射角为10°～70°。扫描完毕，导出文本数据，用Origin软件处理数据并绘制衍射图谱。
采用CMT5105微机控制电子万能材料试验机进行材料极限抗压强度(P)检测。首先计算材料与试验机接触面积，设定加载速率为0.5 mm/min，直至材料碎裂，读出数据。
实际面积＝圆柱体材料横切面外圆面积－内圆面积－圆环中镂空圆体面积
P＝Fm/S
Fm为最大载荷(N)，S为材料接触面积(mm2)
HA/ZrO2梯度复合材料浸提液制备：将经过环氧乙烷灭菌的HA/ZrO2梯度复合材料粉以0.2 g/mL混于含10%胎牛血清的DMEM溶液中，振荡混匀后在37 ℃细胞培养箱中放置72 h，离心后取上清液，过滤除菌，4 ℃冰箱保存备用。MTT步骤：(1)取传代培养的第3代小鼠成纤维细胞株L929用含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培养液、在37 ℃、5% CO2、相对湿度90%的培养箱中培养。(2)取对数生长期贴壁细胞，胰蛋白酶消化，用RPMI 1640完全培养液制备成5×104/mL的细胞悬液接种至96孔板，每孔100 μL，分为实验组、对照组，每组又按不同时间点分为第1天～第6天6个亚组，每亚组4个复孔。96孔板边缘孔用无菌PBS填充。(3)细胞接种后放入37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养24 h，使细胞贴壁。将实验组培养液更换为HA/ZrO2梯度复合材料浸提液，对照组更换为新鲜RPMI 1640培养液。用倒置显微镜进行细胞形态学观察、拍照。(4)更换培养液后继续培养，分别在培养第1、2、3、4、5、6天依次加入20 μL MTT溶液，继续培养4 h后终止培养，弃96孔板中不同培养液，分别加入150 μL DMSO液体，充分混匀10 min，用酶联免疫检测仪在490 nm处测量各组的光密度(optical density, OD值)。OD值越高，则细胞毒性越小。
将16只比格犬随机分为4组，每组4只。A组：截取犬股骨中段15 mm后，不植入生物材料；B组：截取犬股骨中段15 mm后，植入15 mm规格HA/ZrO2梯度复合材料；C组：截取犬股骨中段25 mm，植入25 mm规格HA/ZrO2梯度复合材料；D组：截取犬股骨中段35 mm，植入35 mm规格HA/ZrO2梯度复合材料。
所有股骨干缺损造模手术均由同一组实验人员完成。麻醉及入路同1.2。暴露股骨后，根据各组实验犬截取长度要求，用摆锯分别截去股骨中段15、25、35 mm全层(包括骨膜)制成骨缺损模型，B组、C组、D组植入对应长度HA/ZrO2梯度复合材料。4组均选择合适长度有限接触钢板，骨折断端上下各选择2孔，电钻钻孔，测深，行钢板内固定，C形臂X线机下透视见螺钉长度合适，钢板固定稳妥，股骨断端对线满意。
(1)术后一般情况观察：每天观察比格犬的活动、饮食等基本情况；观察手术切口有无红肿、渗液、脓肿、感染、破溃等情况；观察下肢行走活动情况。
(2)X线影像学观察：分别于术后第2、4、8、12周，在静脉麻醉下，拍摄术肢股骨正侧位X片，观察植入生物材料与自身骨结合情况及周围骨痂生长情况，观察生物材料有无断裂、分解、高度丢失等。
(3)股骨标本的采集及大体观察：术后12周用3%戊巴比妥钠经静脉麻醉后，用空气栓塞法处死实验动物，仔细解剖显露犬实验区股骨，从髋关节至膝关节进行离断，截取整段股骨，取下固定钢板及螺钉，冲洗清理周围软组织。大体观察标本植入区内生物材料与周围骨生长状况。
(4)标本Micro CT扫描新生骨量测定及新生骨图像3D重建：股骨标本用保鲜膜包裹固定后放入Micro CT进行扫描。扫描条件：电压80 kV，电流80 μA，帧平均数4，像素组合1×1。以X线180°平扫，定位全部生物材料植入区域为感兴趣区，采用CT信号选择功能抑制材料本身超高信号区域，形成新生骨CT图像。利用Micro CT计算各组生物材料植入区域的新生骨量，计算出单位面积内新生骨量。利用Micro CT自带分析软件进行新生骨3D重建。
(5)极限抗压实验：股骨标本竖直放置于力学试验机的两平行压盘中间固定，使股骨的长轴平行于压力轴，压缩强度速率设定为0.5 mm/min，载荷从零开始一直到标本破坏为止，测量极限抗压强度(P)。
P＝Fm/S
Fm为最大载荷(N)，S为材料接触面积(mm2)
采用SPSS 17.0统计软件分析。服从或近似服从正态分布的计量资料以
±s表示。多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
将犬股骨干缺损模型置于Micro CT中，形成直观的平扫图像及2D、3D重建图像，拷贝数据，以DICOM格式输出，见图1。将Micro CT已输出的DICOM数据通过MAGICS软件进行转化。转化过程中对数据进行编辑，形成STL格式，见图2。根据所需复合材料的孔隙率要求，对STL格式文件进行进一步地处理，形成一个内圆直径6 mm、外圆直径14 mm的中空圆柱体，圆柱体表面布满直径2 mm、贯通里外的孔洞，以STL格式导出，见图3。
HA/ZrO2梯度复合材料外观呈内层中空的圆柱体，其中外层直径14 mm，内层直径8 mm。由于材料初胚由光固化成型所得，材料孔径分布均匀，约为500 μm，隔层交叉叠加，整体形成蜂窝状结构，见图4。
扫描电镜观察见光固化3D打印梯度复合材料表面光滑，结构均匀，断口表面层均匀过渡结合，没有明显界限，相互之间冶金结合，见图5。
HA/ZrO2梯度复合材料粉末XRD衍射图谱显示：衍射角以2θ角度进行扫描，30.06°处的强衍射峰，其结构为Ca2Zr7O16和CaH2；28.06°和50.18°处的次强衍射峰，均存在ZrO2结构；31.32°和59.70°处的次强衍射峰，均存在CaH2结构。见图6。结果显示，复合材料粉末中ZrO2相依旧存在，而HA相消失，转变为CaH2P2O7、Ca2P2O7、CaP、CaH2相。提示复合材料能通过高温煅烧梯度结合形成梯度复合物，而以CaH2P2O7为主的转变相与水或者体液结合后，在人体正常体温中能再次形成HA，实现它的生物相容性。
注：2θ为衍射角以2θ角度进行扫描
HA/ZrO2梯度复合材料抗压强度检测结果显示：材料与试验机接触面积为(43.6±0.3)mm2时，最大压力为(1 891±116.8)N，极限抗压强度为(43.37±2.31 )MPa。
实验组：细胞在培养1、2 d时为相对静止期，从第2天起细胞均迅速增殖，4 d后进入平台期，细胞增殖减缓。对照组：细胞随着时间延长，缓慢增殖。两组间不同时间点OD值比较，差异均无统计学意义(P值均>0.05)，见表2。结果提示，HA/ZrO2梯度复合材料不影响细胞增殖能力，说明该材料无细胞毒性。
实验组、对照组不同时间HA/ZrO2梯度复合材料MTT检测OD值比较(
±s)
实验组、对照组不同时间HA/ZrO2梯度复合材料MTT检测OD值比较(±s)
| 组别 | 孔数 | 第1天 | 第2天 | 第3天 | 第4天 | 第5天 | 第6天 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 实验组 | 4 | 0.681±0．016 | 0.768±0．020 | 1.008±0．077 | 1.279±0．081 | 1.332±0．021 | 1.401±0．020 |
| 对照组 | 4 | 0.674±0．020 | 0.757±0．029 | 0.953±0．072 | 1.289±0．032 | 1.361±0．013 | 1.432±0．017 |
| t值 | 0.505 | 0.636 | 1.025 | －0.233 | －2.330 | －2.356 | |
| P值 | >0.05 | >0.05 | >0.05 | >0.05 | >0.05 | >0.05 |
注：HA/ZrO2为羟基磷灰石/二氧化锆；MTT为嘧唑蓝；OD为光密度
术毕见实验犬患肢不能着地，患侧髋关节屈曲使足离开地面，行走不平稳，其余肢体无明显异常。术后3 d内进食量及活动量均减少，精神萎靡，切口周围软组织略肿胀，无明显血性及脓性液体渗出；1周后实验犬切口红肿消退，食欲如术前，可自行站立活动，但患肢仍无法着地，考虑疼痛引起的畏惧反应；2周后所有实验犬切口均一期愈合，软组织覆盖良好，切口予以拆线，患肢可着地；术后4周，实验犬四肢活动自如，患肢着地平稳，无跛行。实验过程中，无一例实验动物死亡。
术后2、4、8、12周X线片观察显示：A组随时间推移，骨缺损断端骨痂生成逐渐增多，第8周时骨缺损断端吸收，髓腔封闭，骨痂增生肥厚，形成骨不连。B组HA/ZrO2梯度复合材料与骨缺损断端间隙逐渐被新生骨填充，界线逐渐模糊，至12周时HA/ZrO2梯度复合材料周围新生骨与宿主骨紧密连接在一起，有连续性骨痂通过，HA/ZrO2梯度复合材料与宿主骨之间的界线消失。C组术后2、4、8周反应较A组缓慢，术后4周出现HA/ZrO2梯度复合材料的分解断裂，但HA/ZrO2梯度复合材料与骨缺损断端间隙逐渐被新生骨填充，术后12周显示有连续性骨痂通过。D组新骨生成缓慢，仅在骨缺损断端周围出现新生骨，界线逐渐模糊，术后12周见HA/ZrO2梯度复合材料中段无新生骨长入，仅在骨缺损断端与HA/ZrO2梯度复合材料周围见少量骨痂形成。见图7。
术后12周采集股骨标本：A组骨缺损断端周围骨痂形成，局部膨大，断端血供较好，骨髓腔已封闭，断端中间无明显骨质长入，仅靠纤维包膜覆盖；B、C组骨断端与材料结合处均有明显新生骨覆盖，新生骨与原有骨骨性连接紧密，材料表面几乎被新生骨包埋；D组骨缺损边界模糊，断端与材料结合处骨痂生成，骨缺损中段骨质生成较薄，少许材料显露。
由于A组在骨质愈合修复期时无连续性骨痂通过，已形成骨不连，去除内固定后的离体标本显示断端已遭破坏，无法准确估计其新生骨体积，已失去其检测意义，故不对A组进行新生骨的检测。术后12周B、C、D组股骨标本单位体积内新生骨量依次降低，差异有统计学意义(P<0.01)；其中B组、C组均明显多于D组，差异均有统计学意义(P值均<0.05)；而B、C组间比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。
各组单位体积新生骨量检测结果(mm3/cm3，
±s)
各组单位体积新生骨量检测结果(mm3/cm3，±s)
| 组别 | 例数 | 新生骨量 |
|---|---|---|
| B组 | 4 | 238.55±19.11 |
| C组 | 4 | 223.31±13.41 |
| D组 | 4 | 110.83± 6.48ab |
| F值 | 156.824 | |
| P值 | P<0.01 |
注：B组为截取犬股骨中段15 mm；C组为截取犬股骨中段25 mm；D组为截取犬股骨中段35 mm；与B组比较，aP<0.05；与C组比较，bP<0.05
新生骨Micro CT 3D重建见图8。其中B组HA/ZrO2梯度复合材料已被新生骨组织完全包裹，3D结构图中未见明显材料外露，虽然原缺损部位新生骨未能完全填满，断端存在少许凹陷性缺损，但是整体的股骨塑形已完成。C组骨缺损区域已有连续的新生骨形成，仅存在部分的HA/ZrO2梯度复合材料外露，宿主骨与新生骨塑形完整。而D组虽然股骨干整体解剖结构及力线完整，但HA/ZrO2梯度复合材料整体基本外露，材料表面存在散在的新生骨长入，无连续性骨痂形成及通过。
注：蓝色区域(箭)为HA/ZrO2梯度复合材料
术后12周极限抗压实验结果显示：A组骨折断端仅少量骨皮质相连，属于骨不连范畴。B、C、D组极限抗压强度分别为(49.72±2.33)、(49.81±2.43)、(46.92±3.61 )MPa，差异无统计学意义(F＝1.119，P>0.05)。
目前，临床治疗大段骨缺损运用最广泛的方法有骨移植术、人工替代物置换、牵拉成骨技术、诱导膜技术等[13,14,15]，但都有各自的局限性。骨组织工程学技术的发展为骨缺损修复治疗注入了新的活力，组织工程学中最常用的骨缺损修复材料支架有生物陶瓷、HA、人工可降解聚合物等[16]，但没有单独的一种材料在生物活性及生物力学性能上可以满足骨组织工程支架材料的要求，现今研究主要将一种或多种材料与常用支架材料进行复合，形成新的生物复合材料以发挥不同材料的优势，弥补单一材料的不足[17,18]。
HA/ZrO2梯度复合材料不仅具有HA良好的生物相溶性，其组织结构与天然磷灰石矿物相近，具有与人体硬组织相似的化学成分和结构，是脊椎动物骨和齿的主要无机成分；植入体内后，在体液的作用下，会发生部分降解，游离出人体组织必需的元素钙和磷，并被人体组织吸收、利用，生长出新的组织，从而使植入物和人体组织获得良好的结合；HA结合的第二相颗粒ZrO2可以显著提高材料的断裂韧性，具有更好的力学强度和抗生物腐蚀性。但是采用干铺-烧结方法制备的HA/ZrO2梯度复合材料孔隙率不可控，成品模式固定，而临床上遇到的大段骨缺损多为创伤、感染、肿瘤等因素引起，患者骨缺损的部位及缺损形状大小不尽相同，使得HA/ZrO2梯度复合材料的应用受到限制，特别是对于大于临界骨缺损及复杂的骨缺损部位其应用更有局限性。目前也有新型的生物陶瓷材料用于治疗大段骨缺损，但其操作复杂，都是按照固定模式生产的，难以与患者的缺损部位完美吻合[19]。因此，现阶段的生物材料无法满足骨替代材料个性化强、结构精细及孔径大小和分布多样化的要求。
随着3D打印技术逐渐应用于医学领域，个体化定制型的支架材料应运而生。He等[20]利用光固化3D打印技术制备个体化上颌骨模型并用钢板在模型上模拟手术操作，证明定制模型能使手术中截骨更加快速准确，螺钉能精确导入固定。Li等[21]运用3D打印扫描技术个体化采集信息，制备节段骨骨折、股骨髁间骨折及膝关节软骨面损伤3D支架材料，体外成功修复缺损组织，具备传统修复手段无法比拟的优势。光固化3D打印技术的工作原理是打印槽形成一平面，打印喷头沿设定方向以规定速度来回移动，同时喷射实体材料和支撑材料，并用紫外光照射固化。一层平面打好以后，打印槽下降一平面，重复该过程，层层堆积，最后得到一个3D立体材料[22]。光固化3D打印技术能定向选择性地控制打印的面积，精确地改变复合材料的孔隙及孔径大小，成型精度高，尤其在制作多孔植入体及支架方面具有独特的优势，因此成为近年来生物材料的研究重点。
在本研究中，对骨缺损部位进行螺旋CT逐层扫描，对采集的信息进行3D重建，最终转换为3D打印机可用的STL图像格式，运用光固化3D打印技术将HA/ZrO2梯度复合材料做成需要的个体化的模件，使临床个性化治疗骨缺损成为可能。电镜下可见3D打印HA/ZrO2梯度复合材料具备更加精准的孔径大小及孔隙分布，明显改善以往支架材料制备内部结构不可控的缺陷。通过XRD分析可见，HA/ZrO2梯度复合材料中ZrO2相依旧存在，而HA相消失，转变为CaH2P2O7、Ca2P2O7、CaP、CaH2相，这是因为高温煅烧过程中，HA结构发生转变，释放出Ca2O2，与ZrO2结构结合，形成Ca2Zr7O16。这进一步证明了复合材料能通过高温煅烧梯度结合形成梯度复合物，而以CaH2P2O7为主的转变相与水或者体液结合后，在人体正常体温中能再次形成HA，从而实现良好的生物相容性。抗压强度检测显示，HA/ZrO2梯度复合材料极限抗压强度为(43.37±2.31 )MPa，远远大于正常犬股骨干骨组织力学要求(约15 MPa)[23]，提示HA结合第二相颗粒ZrO2可以显著提高材料的断裂韧性，具有更好的力学强度。同时，本研究结果还显示，HA/ZrO2梯度复合材料无明显细胞毒性，植入动物体内后，无明显免疫排斥反应，随着时间推移，材料可部分降解，但术后力学强度无明显减弱。
需要指出的是，临床中对大段骨缺损一直没有一个明确的定义，动物大段骨缺损的模型也不尽相同。目前动物实验骨缺损模型基本上参考Schmitz等[12]提出的临界骨缺损概念，即动物体内终身不能自行愈合的最小骨缺损定义为临界骨缺损。因此，国内外学者较为普遍的认识是当长骨缺损长度达到该骨直径的1.5倍左右即可定义为大段骨缺损[24,25]。Schmitz等[12]报道犬股骨干骨缺损临界值为15 mm。本研究前期预实验也证明犬股骨中段15 mm骨缺损无法自行愈合；且在本研究中，根据3D重建测得犬股骨干髓腔呈类椭圆形，最长直径达到14 mm，最短直径为10 mm。因此，笔者根据既往文献报道、预实验结果及3D重建测量结果，设计制成股骨中段截骨长度为15、25、35 mm的骨缺损模型。通过3D打印技术结合临床CT扫描数据，个体化制备HA/ZrO2梯度复合材料，植入犬股骨干缺损模型。本研究结果显示，HA/ZrO2梯度复合材料能有效促进新生骨的爬行长入，其骨修复能力明显优于未植入生物材料的骨缺损组。
综上所述，运用3D打印技术制备的纳米HA/ZrO2梯度复合材料具有可靠的生物相容性及生物力学强度，适应临床个体化治疗原则，能很好地修复犬股骨干35 mm之内骨缺损，是一种理想的骨组织替换材料。本研究不足之处为：(1)材料的相关理化性能及生物相容性研究有待进一步完善；需进一步加强跨学科合作，改善3D打印制备工艺，实现多种复合材料混合打印的同时，能精准控制材料比例。(2)动物实验方面，由于前期3D打印技术的研究和探索花费了大量的实验时间，致使后期动物实验观察时间严重缩短，在今后的研究中需进一步改进方法，完善实验模型，增加动物实验的观察时间；本研究中由于硬组织切片制备耗时过长，未能在发文前完成，故未从组织学角度观察新生骨长入情况，需要后期进一步完善。(3)组织工程包括支架材料、生长因子、种子细胞三大基本要素，在今后的实验中需继续完善生长因子及种子细胞的研究，将三者结合，从而得到更加行之有效的骨修复效果。
