探讨人体腓骨体部骨组织显微硬度分布特征。
纳入3具新鲜冰冻成人尸体标本(62岁男性、58岁男性、45岁女性)，均排除骨骼慢性疾病病史。取右侧腓骨体部，垂直于腓骨体部长轴将其切割为6等份，再使用高精度低速锯于每段标本中部取骨组织制成3 mm厚的骨骼标本，并将每个标本分为前侧、内侧、后侧、外侧4个区域。应用维氏硬度测量系统对每个区域进行5次有效显微硬度测量并取得硬度值，分析腓骨体部不同层面及同一层面的前侧、内侧、后侧、外侧4个区域的显微硬度分布特征，比较不同层面、不同区域的显微硬度差异。
3具腓骨体部标本共制备18个骨骼标本，选取72个区域共计测量了360个位点的有效硬度值。3具腓骨体部标本前侧、内侧、后侧、外侧区域总体硬度值分别为(46.81±4.51)HV、(49.69±4.05)HV、(51.19±4.19)HV和(50.44±4.10)HV，其中前侧皮质硬度最低，后侧皮质硬度最高，不同区域总体显微硬度比较差异有统计学意义(F＝18.590, P<0.01)；腓骨体部1～6层面总体显微硬度分别为(48.63±4.88)HV、(49.66±4.19)HV、(49.50±4.67)HV、(51.07±4.08)HV、(49.96±4.24)HV、(48.39±4.63)HV，其中腓骨体部第4层面硬度最高，第6层面硬度最低，不同层面间总体显微硬度比较差异有统计学意义(F＝2.830, P<0.05)。同一区域不同层面间显微硬度比较差异均无统计学意义(P值均>0.05)。同一层面内，1～4层面不同区域间显微硬度比较差异均有统计学意义(P值均<0.05)，而第5、6层面不同区域间显微硬度比较差异均无统计学意义(P值均>0.05)。
腓骨体部不同层面和不同区域骨组织显微硬度分布存在差异。了解不同区域、不同层面间骨显微硬度差异，可帮助骨科医生在自体腓骨移植中，正确选择腓骨植入时放置的方向，减少移植物疲劳骨折的发生，还可以为制造更高精度的3D打印仿生骨提供数据支持。
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腓骨体形态笔直，主要由致密的皮质骨组成。腓骨体部有三面及三缘，近端截面近似三角形，中段及远端截面呈不规则形。与胫骨相比腓骨更为纤细，传统观念认为，腓骨没有直接的承重作用，腓骨的主要功能是组成踝关节及作为肌肉的附着点。作为"非承重骨"，除远端腓骨外，在发生腓骨骨折或缺损时，常常不给予骨折固定或缺损修复[1]。不仅如此，当出现长骨、颌面部骨缺损或股骨头坏死时，腓骨还常常被用作自体骨供体[2,3]。成功的自体腓骨移植需要对腓骨的解剖有着深入的理解。因此，很多学者使用不同方法研究了腓骨的形态特征及其在移植手术中的应用[4,5]。但既往的研究只考虑了腓骨的形态，忽略了骨组织的材料性质差异。有学者认为长骨骨干的皮质骨是均质的，不同解剖部位骨组织材料属性不存在差别[6]。目前尚缺少对腓骨体骨组织生物力学性质的研究，这可能对腓骨移植手术的效果带来相当的影响。压痕(indentation)技术测得的骨硬度(bone hardness)可以很好地反映骨的生物力学特性，其结果与骨组织的弹性模量及屈服强度有着很好的相关性[7]。我们使用显微压痕技术(micro-indentation technique)在人体骨骼显微硬度系统研究的框架下[8]测量腓骨体部骨组织显微硬度并对其分布特征进行分析，旨在探讨腓骨体骨组织的生物力学性质。本研究不仅能够为腓骨的解剖学研究提供一定的补充，还可以为3D打印与人体结构和功能相近的仿生骨提供数据支持。
标本纳入标准：(1)新鲜冰冻成人尸体标本，右下肢完整；(2)年龄大于40岁，性别不限；(3)既往无慢性病史；(4)捐献者生前授权或家属知情同意，并签署遗体捐献同意书。排除标准：(1)腐败或经防腐处理后的尸体；(2)生前患有影响骨骼质量的疾病；(3)既往下肢骨折或手术史；(4)经影像学检查诊断为骨质疏松；(5)下肢先天畸形；(6)原发性骨肿瘤或肿瘤骨转移。
纳入3具右侧新鲜冰冻腓骨标本(由河北医科大学解剖教研室提供)，分别为62岁男性、58岁男性、45岁女性，实验前将遗体标本放入－20 ℃冷柜中保存。本研究经河北医科大学第三医院伦理委员会批准(批文号：科2017-003-1)，并在中国临床试验注册中心注册(注册号：ChiCTR-BPR-17010818)。
取出右侧腓骨标本，剔除软组织，按照Heim方块法则将腓骨分为近端、体部、远端三部分。使用美国Buehler公司BUEHLER11-1280-250型高精度低速锯，垂直于腓骨体部长轴将腓骨体部切割为6等份，再分别于每段标本的中部取骨组织制成3 mm厚的骨骼标本，固定于纯平玻片并进行标记。找到骨标本髓腔中心，通过该点做出标本的前-后，左-右轴线。以髓腔中点为旋转中心，将标本的前-后、左-右轴线旋转45°后，2条轴线将腓骨体部皮质骨分为前侧、内侧、后侧、外侧4个区域。腓骨体部不同层面骨骼标本的取样位置及区域划分见图1A、图1B。使用400、800、1 200、2 000目砂纸依次打磨标本表面使之平滑。打磨后将骨骼标本放入－20 ℃冰箱恒温密封保存。
注：虚线框内为腓骨体部；红线为6等分线
使用德国维氏硬度测量系统(Model KB5BVZ-Video)测量每层标本4个区域的骨组织显微硬度，测量单位为HV(1 kgf/mm2)。每次测试前，将标本浸入林格液中浸泡30 min，使标本再水化，避免干燥对标本硬度测量的影响。在每次压痕操作前，使用显微硬度测量系统自带的显微镜确定实验区域骨面完整，远离骨边缘，且待测位点骨表面完整光滑。不同压痕之间保持距离大于5倍压痕对角线长度，以避免压痕间相互影响。根据美国材料与试验协会制定的材料显微硬度标准测量规范及既往的实验研究方法[9,10,11]进行检测：设定50 gf加载力，加载时间50 s，维持时间12 s。通过显微硬度测量系统自带软件读取每个压痕的2条对角线长度，选取对角线长度差异小于10%的压痕为有效压痕，应用维氏显微硬度测量系统自带软件计算硬度值，每个区域选取5个有效硬度值，全体有效值的平均值作为该部位的显微硬度值。本系列研究的显微维氏硬度测量方法相同，见文献[8]。见图2。
分析腓骨体部1～6层面及同一层面前侧、内侧、后侧、外侧4个区域的显微硬度分布特征，比较不同层面、不同区域的显微硬度差异。
应用SPSS 24.0统计学软件处理数据。服从正态分布的计量资料以
±s表示。各组间显微硬度值的比较采用单因素方差分析，两两比较中方差齐的组间采用Tukey检验，方差不齐采用Dunnett T3检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
3具腓骨体部标本，共制备骨骼标本18个，选取72个区域共计测量了360个有效硬度值，腓骨体部总体硬度31.30～61.20(49.53±4.52)HV。
3个腓骨体标本间总体硬度值比较差异无统计学意义(P>0.05)；腓骨体部不同区域总体硬度值比较差异有统计学意义(P<0.01)，其中前侧硬度值最小，后侧硬度值最大。腓骨体部第1～6层面总体硬度值，比较差异有统计学意义(P<0.01)，其中第4层面硬度最高，第6层面硬度最低。见表1。
3具成人尸体标本腓骨体不同标本及不同区域、层面总体显微硬度值比较(HV, 
±s)
3具成人尸体标本腓骨体不同标本及不同区域、层面总体显微硬度值比较(HV, ±s)
| 观察项目 | 测量位点 | 显微硬度 | |
|---|---|---|---|
| 标本 | |||
| 1 | 120 | 49.11±5.68 | |
| 2 | 120 | 50.23±3.82 | |
| 3 | 120 | 49.26±3.73 | |
| F值 | 2.182 | ||
| P值 | >0.05 | ||
| 区域 | |||
| 前侧 | 90 | 46.81±4.51 | |
| 内侧 | 90 | 49.70±4.05a | |
| 后侧 | 90 | 51.19±4.19a | |
| 外侧 | 90 | 50.44±4.10a | |
| F值 | 18.590 | ||
| P值 | <0.01 | ||
| 层面 | |||
| 1 | 60 | 48.63±4.88b | |
| 2 | 60 | 49.66±4.19 | |
| 3 | 60 | 49.50±4.67 | |
| 4 | 60 | 51.07±4.08 | |
| 5 | 60 | 49.96±4.24 | |
| 6 | 60 | 48.39±4.63b | |
| F值 | 2.830 | ||
| P值 | <0.05 | ||
注：与前侧比较aP<0.05；与第4层比较bP<0.05
同一区域不同层面间显微硬度比较差异均无统计学意义(P值均>0.05)。同一层面内，第1～4层面不同区域间显微硬度比较差异均有统计学意义(P值均<0.05)，而第5、6层面不同区域间显微硬度比较差异均无统计学意义(P值均>0.05)。见表2。
3具成人尸体标本腓骨体不同层面、不同区域显微硬度值的比较(HV, 
±s)
3具成人尸体标本腓骨体不同层面、不同区域显微硬度值的比较(HV, ±s)
| 层面 | 测量位点 | 前侧 | 内侧 | 后侧 | 外侧 | F值 | P值 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 1 | 60 | 45.61±4.37 | 47.98±5.24 | 50.64±3.93a | 50.29±4.57a | 3.944 | <0.05 |
| 2 | 60 | 46.59±4.59 | 50.30±3.51 | 50.78±3.20a | 50.95±4.10a | 4.208 | <0.05 |
| 3 | 60 | 46.93±3.97 | 49.74±4.32 | 52.01±5.12a | 49.30±4.16 | 3.340 | <0.05 |
| 4 | 60 | 47.54±3.69 | 51.61±2.64a | 53.30±3.34a | 51.83±4.33a | 7.255 | <0.01 |
| 5 | 60 | 47.73±4.35 | 50.45±4.11 | 51.66±3.88 | 50.01±4.05 | 2.406 | >0.05 |
| 6 | 60 | 46.45±6.14 | 48.10±3.31 | 48.77±4.58 | 50.23±3.58 | 1.790 | >0.05 |
| F值 | 0.431 | 1.949 | 2.118 | 0.656 | |||
| P值 | >0.05 | >0.05 | >0.05 | >0.05 |
注：同一层面与前侧比较aP<0.05
显微压痕技术测得的骨显微硬度可以很好地反映骨质量，其结果与骨的弹性模量及屈服强度有着很高的相关性[7]。在生理条件下，骨硬度主要受骨组织的次级矿化过程影响，其数值反映了局部骨组织的受力历程[12,13]，局部应力/应变较高的区域骨组织矿化增加，硬度增大。腓骨为下肢的辅助承重结构一般认为其承重作用较小，因而腓骨体常常被用做自体骨供体。了解腓骨体部生物力学性质对了解腓骨的承重作用及提高自体骨移植手术的长期效果至关重要。很多学者曾对腓骨的整体生物力学性质[14]、形状及皮质厚度[15]、骨骼矿物质分布[16]进行了研究，但查阅文献资料笔者发现，目前尚无腓骨不同解剖区域骨组织显微硬度分布的数据资料。
传统观点认为，长骨骨干皮质骨的生物力学性质是均质的[6]，但本研究结果不支持此种观点。本研究结果显示，腓骨体不同区域的骨组织显微硬度有所不同，前方皮质显微硬度最低，显著小于其他区域，后方皮质显微硬度最高；腓骨体部不同部位骨硬度也不尽相同，其中部(层面4)最高，下端(层面6)最低。
腓骨在下肢的承重作用仍存在争议，很多学者认为，腓骨负重占下肢整体负重的6%～19%[15]。胫腓骨所处的生物力学环境存在着相当的差异。胫骨更为粗壮，其近端关节面承受了来自体重的绝大部分垂直压缩载荷，并将此垂直载荷传递至足部[17]；与此同时，胫骨还承受了步态周期中的前后向弯曲及部分扭转载荷[18]：所以，理论上胫骨的整体刚度应远大于腓骨。Cristofolini等[14]通过生物力学研究也验证了此观点，腓骨的刚度比胫骨和股骨小1～2个数量级。在我们之前的研究中，测得胫骨体部骨组织骨平均显微硬度值为51.20 HV，股骨为47.53 HV[19]。在本研究中，腓骨体骨组织显微硬度为(49.53±4.52)HV，与既往研究比较，腓骨体部显微硬度值略小于胫骨，大于股骨。故笔者认为，胫、腓骨骨材料生物力学性质的差异也是二者刚度差异的重要来源。根据骨的功能性适应理论[20]可以推测，腓骨体骨组织承受了与胫骨以及股骨相近的应力。王娟等[21]研究发现，在膝关节骨关节炎的进展过程中，腓骨在其承载的负荷作用下逐渐弯曲。这些结果都印证了腓骨在膝关节周围具有一定的承重作用。此外，还有很多研究报道，腓骨中下段部分切除术后患肢会有不同程度的功能障碍，包括踝关节外翻、活动受限、步态协同行降低、跑步不稳等[22,23,24]。因此，临床中腓骨中下段骨缺损还应当予以修复。
本研究还发现，腓骨不同区域骨组织显微硬度有着显著的差异，前侧硬度值最小，后侧硬度值最大。此差异可能与小腿的负重模式有关，在正常生理条件下，下肢力线在矢状面偏向于小腿后方，接近于胫骨后方皮质[25]。不仅如此，Yang等[18]研究发现，在步行及跑步过程中小腿承受了前后向的弯曲力矩。这些因素均可导致胫、腓骨后方皮质承担了更大的负荷，局部更高的应力导致后方皮质硬度增加，前方皮质硬度低于其他部分。腓骨移植常用于治疗长骨缺损，然而由于腓骨与其他长骨相比更为纤细，术后1年内经常发生移植骨疲劳骨折[26]。本研究结果显示，腓骨后侧皮质硬度最高，能够起到更好的支撑作用；而前侧皮质硬度最低，应避免前侧皮质承受较大的应力。笔者认为，腓骨移植时应考虑到腓骨不同区域皮质材料性质的不均匀性，移植物植入时腓骨的放置应有一定的方向性，这样可能会减少疲劳骨折的发生。此结果仅来自于理论分析，尚需要进一步的实验验证。
近年来随着3D打印技术的发展，3D打印骨移植物逐渐成为骨缺损修复的重要手段。然而当前的3D打印技术通常使用均质材料，此类移植物难以适应人体内复杂的生物力学环境，移植物植入人体后由于其整体刚度及其局部组织弹性模量与周围缺少一致性，可出现植入物局部微损伤的累积甚至疲劳骨折。也可能因应力遮挡出现植入物周围骨吸收而出现植入物松动。本研究结果所获得数据可以指导制造与人体骨骼弹性模量一致的更高精度的仿生骨，减少移植物疲劳骨折以及移植物周围骨吸收等不良事件的发生。
本研究旨在探讨腓骨体骨组织显微硬度的固有分布规律，而非显微硬度的标准值；同时样本量少，研究结果在3D打印骨移植物中的作用还需要扩大样本量，进一步的生物力学及动物和实验研究验证；本研究局限于年龄大于40岁的健康成人，对于青少年、疾病和创伤状态下的骨硬度需要进一步研究。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
