总结拉曼光谱技术在骨关节炎早期诊断中的应用相关研究进展。
以"拉曼光谱""共焦拉曼光谱""拉曼显微镜""滴液沉积""表面增强拉曼光谱""光纤拉曼光谱""拉曼光谱带""骨关节炎""软骨"，以及"Raman spectroscopy""Raman microspectroscopy""confocal Raman spectroscopy""drop deposition Raman spectroscopy""surface-enhanced Raman spectroscopy""fiber-optic Raman spectroscopy""Raman bands""osteoarthritis""cartilage"等为中、英文关键词，在中国知网、万方数据库、PubMed等中英文数据库中检索2018年12月之前发表的有关拉曼光谱技术及其在骨关节炎早期诊断中应用的文献1 432篇，剔除内容不符、无法获取全文、重复性研究以及存在设计缺陷的文献，最终纳入34篇文献，进行总结和分析。
拉曼显微镜、共焦拉曼光谱、光纤拉曼光谱技术可对骨关节炎早期软骨微观改变进行评价；液滴沉积拉曼光谱法、表面增强拉曼光谱技术可为骨关节炎早期滑膜液、血液改变提供诊断依据。
拉曼光谱技术在骨关节炎早期诊断中显示出了很好的应用前景，但其检验标准及实用性仍有待进一步研究探讨。
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骨关节炎是临床常见的骨关节疾病，世界人口约15%罹患骨关节炎，它是一种引起关节疼痛和功能障碍的慢性退行性疾病，主要影响老年人的膝关节和髋关节[1,2]。骨关节炎的中晚期诊断依赖于患者的整体临床表现(疼痛、关节肿胀、活动困难、病史等)和影像学资料。在骨关节炎的早期，生化因素和机械因素导致关节软骨浅层发生微小改变，增加了软骨之间的摩擦；但由于软骨磨损轻微，难以通过常规影像学资料进行诊断[3]。
拉曼光谱技术是一种由激光产生，基于单色光的非弹性散射振动光谱技术[4,5]。由于原子间不同的振动能量和模式，每个分子都有自己特有的振动特性，因此拉曼光谱就像"指纹"一样可以提供关于特定分子结构的特征信息[4,6,7]。拉曼光谱仪器是实现光谱分析的物质基础，由光源、收集系统、分光系统、探测器和分析软件组成[8]。通过不同的拉曼光谱测量方法，可以测定骨关节炎极早期软骨、关节液产生的微观改变，从而进行骨关节炎的早期诊断。近年来，拉曼光谱已成功地应用于各种生物组织的研究，显示出良好的应用前景，如在肿瘤[9]、动脉粥样硬化[10]等疾病的诊断中应用。本文旨在综述拉曼光谱技术应用于骨关节炎早期诊断的最新进展。
本文以"拉曼光谱""共焦拉曼光谱""拉曼显微镜""滴液沉积""表面增强拉曼光谱""光纤拉曼光谱""拉曼光谱带""骨关节炎""软骨"，以及"Raman spectroscopy""Raman microspectroscopy""confocal Raman spectroscopy""drop deposition Raman spectroscopy""surface-enhanced Raman spectroscopy""fiber-optic Raman spectroscopy""Raman bands""osteoarthritis""cartilage"等为中、英文关键词在中国知网、万方数据库、PubMed等中英文数据库中检索2018年12月前发表与拉曼光谱在骨关节炎早期诊断中应用相关的文献1 432篇，经阅读文章标题与摘要，剔除内容不符、无法获取全文、重复性研究以及存在设计缺陷的文献，最终纳入34篇文献(图1)。
直接运用拉曼光谱仪对关节软骨进行测量，通过对比拉曼光谱带[11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22]中的信息(表1)，可评价早期骨关节炎的软骨磨损。Takahashi等[13]运用拉曼光谱对人体膝关节软骨改变进行检测，发现在激发波长为647.1 nm的反向散射条件下，随着骨关节炎从早期(Ⅰ级)进展到晚期(Ⅳ级)，骨关节炎的主要生化改变发生在软骨中。de Souza等[4]将拉曼光谱技术应用于两组大鼠骨关节炎模型，对大鼠胫骨平台不同部位的软骨进行测定，记录拉曼光谱值，并与特征拉曼光谱带进行对比；结果显示，拉曼光谱可以有效测算出大鼠胫骨平台软骨的损伤程度。
关节组织中最突出的拉曼光谱带分布
关节组织中最突出的拉曼光谱带分布
| 波数(cm－1) | 结构分布 | 成分 |
|---|---|---|
| 1 685 | AmideⅠ，β-sheet | SF |
| 1 668 | C-O stretching; amide I, random coil | SF, AC |
| 1 655 | AmideⅠ，α-helix | SF |
| 1 640 | AmideⅠ，collagen secondary str. | AC |
| 1 606 | C＝C stretching; phenylalanine, tryptophan | AC |
| 1 557 | AmideⅡ | AC |
| 1 450 | CH2/CH3 scissoring; collagen and other proteins | SF, AC |
| 1 424 | COO－；glycosaminoglycans | AC |
| 1 412 | COO－ symmetric stretching | SF |
| 1 380 | CH3; glycosaminoglycans | AC |
| 1 370 | COO－ symmetric stretching; hyaluronic acid | SF |
| 1 340 | CH2/CH3 wag | SF |
| 1 313 | CH2/CH3 twist | SF |
| 1 270 | (NH2) bending; amideⅢ，α-helix | AC, SB |
| 1 260 | AmideⅢ，α-helix | SF, AC, SB |
| 1 245 | (NH2) bending; amideⅢ，random coil | AC, SB |
| 1 235 | AmideⅢ，random coil | SF, AC, SB |
| 1 206 | CH2 twist; hyaluronic acid | SF |
| 1 163 | Pyranose ring | AC |
| 1 125 | C-C, C-OH, C-N stretching, C-O-Cglycosidic linkage | SF, AC |
| 1 080 | C-N, C-C stretching | SF |
| 1 074 | CO32－ stretching; carbonated hydroxyapatite | CB |
| 1 063 | SO3-stretching; glycosaminoglycans(chondroitin sulfate) | AC |
| 1 042 | Pyranose ring | AC |
| 1 033 | Phenylalanine ring breathing | SF |
| 1 003 | Phenylalanine ring breathing | SF, AC, SB |
| 958 | PO43－ stretching; phosphated hydroxyapatite | CB |
| 941 | C-C stretching; collagen，α-helix | SF, AC |
| 895 | C-C stretching | SF |
| 875 | C-C stretching; hydroxyproline | AC, SB |
| 858 | C-C stretching; proline | AC, SB |
| 816 | C-C stretching; protein backbone | AC |
注：SF为滑膜液；AC为关节软骨；SB为软骨下骨；CB为松质骨
拉曼显微镜技术是一种通过对分子特定振动频率的测量，从而进行样品的微区分析，再通过软件整合，将数据通过多种方式进行表达的技术。Buchwald等[23]在对髋骨关节炎和股骨颈骨折患者(骨折前无骨关节炎)的股骨头中心区域、软骨下区域(负重区)和下内侧区域(非负重区)样本的研究中发现，拉曼显微技术可用来评价软骨下骨和松质骨因骨关节炎引起的细胞外基质的生化变化和结构变化，进而评估软骨、软骨下骨和松质骨的退变情况：通过方差分析显示，骨关节炎和非骨关节炎患者松质骨之间差异无统计学意义；软骨下骨的情况则不同，骨关节炎患者软骨下骨的重塑较大，而同一样本的负重区与非负重区之间差异无统计学意义，这表明在骨关节炎病程中，生化因素对软骨下骨的组成和分子结构的影响要强于机械因素。Kerns等[24]研究也得出了类似的结论，取Ⅳ级骨关节炎患者的胫骨平台与非骨关节炎的样本进行对比，用激发波长为830 nm的拉曼显微光谱仪进行检测，结果发现软骨下骨在骨关节炎病程进展中明显增厚，并发生显著生化改变。由此可见，拉曼显微镜技术可以用于骨关节炎早期对软骨下骨、松质骨进行有效地评估。
共焦拉曼光谱是将激光束聚焦于样品表面，再通过将激光聚焦于样品的不同层，对样品进行剖层分析[25]。Kumar等[12]采用共焦拉曼光谱法对不同程度的骨关节炎关节软骨标本进行蛋白二级结构和蛋白多糖含量的定量分析，采集12个关节软骨标本的拉曼光谱，根据国际软骨修复协会分级将其分为Ⅰ级组(4个标本)、Ⅱ级组(4个标本)、Ⅲ级组(4个标本)；使用632.1 nm波长的共焦拉曼显微镜进行光谱采集，结果显示，Ⅰ级组与Ⅱ、Ⅲ级组比较差异均有统计学意义，Ⅱ级组与Ⅲ级组的差异无统计学意义，这表明在骨关节炎的早期，生化因素在疾病的进展中比机械因素发挥的作用更大，而机械因素在骨关节炎中晚期作用更显著。Kumar等[26]另一项研究测试了从不同国际软骨修复协会软骨损伤分级的、经甲醛固定的骨关节炎软骨标本中分离出来的软骨细胞，验证是否可以用多变量统计学方法进行诊断，结果显示：通过共焦拉曼光谱检测国际软骨修复协会软骨损伤分级Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级的骨关节炎标本特异性，分别为100.0%、98.1%、90.7%，灵敏度分别为98.6%、82.8%、97.5%，总体准确率为92.2%。这些研究显示，在骨关节炎早期，蛋白多糖的合成会因为蛋白多糖的丢失而显著增多，酰胺Ⅲ和蛋白多糖的含量比值可能是骨关节炎早期检测的生物标志物，可以通过共焦拉曼光谱法进行早期诊断。
液滴沉积是一种基于"咖啡环"效应的技术，将少量液体滴在固体基质上干燥，液体干燥的过程中，成分会粗略地分离，由于荧光的成分会趋向于干滴中心，来自弱拉曼散射体的成分的信号会明显增强，有助于从低浓度溶液中检测拉曼光谱[27,28]。Esmonde-White等[15]将DDRS应用于不同程度骨关节炎的膝关节滑膜液，室温下将滑膜液滴在玻片上过夜晾干，使用非增强拉曼光谱进行检测，特征峰显示其成分主要由蛋白质组成。Ortiz等[29]对蛋白质和滑膜液中成分进行分析发现，蛋白质在液滴沉积实验中可以保持构象，氨基聚糖和脂质等其他滑膜液成分之间的相互作用可以改变蛋白质拉曼光谱带的整体结构。因此，DDRS可以应用于骨关节炎早期、关节腔积液较少的情况下的滑膜液分析，从而为骨关节炎的诊断提供证据。
SERS是一种对拉曼散射强度进行放大的振动光谱技术[30]。未增强的拉曼光谱无法在生理浓度下对透明质酸检测。Dehring等[31]的研究使用SERS技术测量了透明质酸的微弱拉曼信号，通过在特制基底上对滑膜液进行沉积和干燥，可以有效检测到透明质酸，同时采用三氯乙酸处理方案，可以明显减少其他蛋白对透明质酸的干扰。Pavelka等[32]研究证实，血清透明质酸基础水平较高的患者膝骨关节炎进展较快。SERS通过对血清透明质酸的检测，可以在一定程度上预测骨关节炎的发展，但其诊断价值有限。
光纤拉曼光谱是将定制设计的手持光纤探头运用在关节镜检查中，可以用于诊断和治疗受损的关节[33]。Esmonde-White等[18]对两组人类尸体标本进行关节镜检查，通过将光谱成像，基于分子结构和化学成分的对比，对健康组织和病变组织进行区分。膝关节组织的光纤拉曼光谱显示，完整软骨的光谱既有软骨信号，也有软骨下骨信号；在局灶性骨关节炎部位的光谱中，软骨下骨信号明显强于完整软骨信号，而在完全病变部位，仅观察到软骨下骨信号。结果表明，由于大量的光学散射体在软骨的胶原蛋白和聚糖中扩散，导致软骨下骨的拉曼光谱信号较弱，所以软骨厚度对软骨下骨信号的采集起着重要的作用，可以作为软骨与骨相对含量的光谱标记，从而评价早期骨关节炎的软骨磨损程度。
目前，对骨关节炎的早期诊断尚无统一的标准，通常采用MRI、关节镜等检查进行诊断。MRI作为一种无创检查方法，虽然简单方便，但受限于图像分辨率和关节腔积液的信号干扰两方面因素，MRI检查对于软骨损伤的敏感性和特异性并不突出，尤其对于早期软骨退变的诊断效率不佳[34]。常规关节镜对骨关节炎的诊断是通过关节镜下直视软骨退变，是一种定性检查，无定量依据，同时对极早期无形态学特征改变的软骨退变无法做到准确判读，但关节镜可以在诊断的同时进行关节清理，对早期骨关节炎进行治疗。而拉曼光谱具有多种检测方法，其检测效率更高，同时也具有定性到半定量的进步。
综上所述，拉曼光谱能够区分健康和患病的关节组织，甚至在疾病的早期阶段可以提供关节各组织在分子水平发生变化的信息，为骨关节炎早期诊断提供可靠的依据。这一技术在骨关节炎的早期诊断中有着潜在的应用前景，值得进一步深入研究探讨。目前仍存在很多关键性的问题亟待解决，如针对骨关节炎的拉曼检验标准、如何排除复杂组织和成分的干扰等；因此，拉曼光谱技术在骨关节炎的诊断中的大面积普及和应用依然任重道远。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
