Effect of local injection of nerve growth factor and basic fibroblast growth factor on the healing of tibial fracture in rats

Yuan He; Tong Jiuhui; Wang Bin; Ma Wei

doi:10.3760/cma.j.issn.2095-7041.2020.01.013

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• 实验研究 •

局部注射神经生长因子及碱性成纤维生长因子对大鼠胫骨骨折愈合的影响

中华解剖与临床杂志, 2020,25(01) : 74-81. DOI: 10.3760/cma.j.issn.2095-7041.2020.01.013

摘要

目的

探讨局部注射神经生长因子(NGF)及碱性成纤维生长因子(BFGF)对大鼠胫骨骨折愈合的影响及其机制。

方法

选取12周龄清洁级成熟雄性SD大鼠48只，用数字表法随机分为NGF组、BFGF组、NGF＋BFGF组、对照组4组，各12只；每组大鼠按观察时间点不同随机分为术后2周及术后4周2个亚组，每亚组6只。48只大鼠均建立左胫骨骨折模型，并行1 mm克氏针髓内内固定。术后第3天于骨折断端周围局部经皮注射给药：NGF组注射NGF 0.8 μg＋0.3 mL生理盐水，BFGF组注射BFGF 1.2 μg＋0.3 mL生理盐水，NGF＋BFGF组注射NGF 0.8 μg＋BFGF 1.2 μg＋0.3 mL生理盐水，对照组注射0.3 mL生理盐水；每天注射1次，连续注射7 d。术后2周、4周分别行X线摄片，并采集各组大鼠股动脉血液标本后，采用颈椎离断法处死大鼠。取各组大鼠左胫骨骨痂标本，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测碱性磷酸酶(ALP)含量；将骨痂组织制成病理切片，行HE染色，观察组织学特点；应用多功能真彩色细胞图象分析管理系统计算切片中骨组织的骨小梁表面成骨细胞指数(IOB)、骨小梁宽度(TW)、骨小梁面积百分比(TV)；采用蛋白芯片技术检测大鼠血清中骨形成蛋白-2(BMP-2)、血管内皮生长因子(VEGF)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)的含量。

结果

(1)术后2周、4周X线摄片：NGF、BFGF、NGF＋BFGF三组大鼠骨折愈合均较对照组快，以NGF＋BFGF组愈合最快。(2)ELISA检测：对照组、NGF组、BFGF组、NGF＋BFGF组术后2周骨痂组织中ALP的含量分别为(110.02±1.92)、(140.87±2.22)、(136.12±1.23)、(187.44±0.90)ng/mL，术后4周骨痂组织中ALP的含量分别为(91.23±1.47)、(106.62±1.64)、(104.83±1.05)、(130.59±1.18)ng/mL；各观察时点4组间比较，NGF＋BFGF组含量最高，组间两两比较差异均有统计学意义(P值均<0.05)。(3)组织学观察：不同时间点上NGF、BFGF、NGF＋BFGF三组大鼠在骨痂的生长、骨小梁形成均较对照组明显，且NGF＋BFGF组优于其他组。骨小梁形态学指标测量显示，不同时间点4组间比较，对照组、NGF组、BFGF组、NGF＋BFGF组大鼠骨痂内骨小梁IOB、TW、TV均呈上升趋势，NGF＋BFGF组最高；组间两两比较，除NGF组与BFGF组各指标差异均无统计学意义(P值均>0.05)，其他指标组间差异均有统计学意义(P值均<0.05)。(4)蛋白芯片检测：不同时间点4组间比较，除VEGF含量在术后4周时差异无统计学意义(P>0.05)，VEGF术后2周及BMP-2、IGF-1术后2周、4周时，NGF组、BFGF组、NGF＋BFGF组均高于对照组，NGF＋BFGF组含量最高，组间两两比较，差异均有统计学意义(F＝198.285、368.060、2006.017、33.332、292.643，P值均<0.05)。

结论

NGF及BFGF均能促进大鼠胫骨骨折愈合，且两者联合应用有协同作用。其机制可能与能够促进骨折愈合过程中VEGF、BMP-2、IGF-1的表达有关。

引用本文: 袁鹤, 童九辉, 王斌, 等. 局部注射神经生长因子及碱性成纤维生长因子对大鼠胫骨骨折愈合的影响 [J] . 中华解剖与临床杂志,2020,25 (01): 74-81. DOI: 10.3760/cma.j.issn.2095-7041.2020.01.013

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骨折是常见的骨科疾病，其愈合过程涉及复杂的生理机制。随着医疗技术及理念的进步，骨折的治愈率逐年提高，但骨不连仍然是临床医生面临的重要难题之一。有研究证实，许多细胞因子，如神经生长因子(nerve growth factor, NGF)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast grouth factor, BFGF)等在骨折加速愈合过程中起重要作用^[1,2]。在本研究中，通过在大鼠胫骨骨折断端局部注射NGF和BFGF，探讨NGF、BFGF对骨折愈合的影响，为骨不连的治疗探索一种新的微创治疗方法。

1　材料与方法

1.1　实验动物

选用12周龄清洁级成熟雄性SD大鼠48只，体质量(250±25) g，由斯贝福(北京)生物技术有限公司提供，动物许可证号：SCXK(京)2016-0002。所有的动物饲养于河北医科大学第二医院实验动物中心，温度为18～24 ℃、湿度为60%～70%的干净环境中，分笼饲养，自由饮水及进食。所有实验动物实验前常规行下肢X线摄片，以排除下肢生长发育畸形。本实验获得河北医科大学第二医院动物伦理委员会批准(2017-P039)，并遵循实验动物使用的相关规定。

1.2　主要试剂及仪器设备

10%水合氯醛、4%多聚甲醛注射液、10%乙二胺四乙酸钠、苏木紫-伊红染色试剂、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)抗体(武汉博士德生物公司)，骨形成蛋白-2 (bone morphogenetic protein 2, BMP-2)抗体、胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor 1, IGF-1)抗体(英国Abcam公司)，生物素标记的VEGF抗体、生物素标记的BMP抗体、Cy3标记的链霉亲和素(美国Invitrogen公司)，生物素标记的IGF-1抗体(美国Bio-Rad公司)，蛋白芯片点样液、晶芯高分子三维基片(北京博奥生物有限公司)，牛血清白蛋白(德国BioFrox公司)。多功能真彩色细胞图象分析管理系统(美国Media Cybernetics公司Image-Pro Plus)，显微镜(日本奥林巴斯BX51T-PHD-J11),酶标仪(美国BIO-TEK, Elx800)。蛋白芯片点样仪(Smart Arrayer™ 136 Microarray Spttor)、芯片杂交仪(BioMixer™Ⅱ Microarray Hybridizer )、芯片洗干仪(Slide Washer™8 Microarray Washer)及芯片扫描仪(LuxScan™10k Microarray Scanner)均由北京博奥生物有限公司提供。

1.3　分组方法

用数字表法将48只SD大鼠随机分为NGF组、BFGF组、NGF＋BFGF组、对照组，每组各12只。每组大鼠按观察指标的时间点不同随机分为术后2周及术后4周2个亚组，每亚组6只。

1.4　大鼠胫骨骨折模型制备

参考刘建军等^[3]建模方法，选取大鼠左侧后肢制备胫骨中段骨折模型。以10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)行大鼠腹腔内注射麻醉后，将大鼠置于固定板上。常规于左侧后肢小腿前外侧做一纵行切口，显露胫骨中段，用线锯将胫骨从胫骨中段1/2处锯断，形成横行骨折。使用电钻将直径1 mm克氏针逆行穿入髓内固定骨折断端，检查骨折固定稳定。生理盐水反复冲洗切口后，逐层关闭切口。

1.5　术后处理及给药方法

术后观察有无因麻醉或手术致死情况，各组大鼠切口周围肌内注射庆大霉素5万单位/天，每日1次，连续注射5 d。观察切口愈合情况，以及有无切口周围红肿及脓性分泌物。

术后第3天开始，骨折断端处局部经皮注射给药：NGF组大鼠注射NGF 0.8 μg＋0.3 mL生理盐水^[4]，BFGF组大鼠注射BFGF 1.2 μg＋0.3 mL生理盐水^[5]，NGF＋BFGF组大鼠注射NGF 0.8 μg＋BFGF 1.2 μg＋0.3 mL生理盐水，对照组注射0.3 mL生理盐水；每日1次，连续注射7 d。

1.6　X线检查

分别于术后2周及术后4周应用10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔内麻醉相应亚组的大鼠后，拍摄大鼠双侧下肢X线正位片。X线检查参数：电压45 kV，电流50 mA，曝光时间0.2 s。观察术后2周、4周X线上骨折断端骨折线、骨痂生长、骨桥接等变化，从而判断骨折愈合情况。

1.7　ELISA检测ALP

X线摄片完毕并采集股动脉血标本后，采用颈椎离断法处死大鼠，取大鼠胫骨中段，充分去除软组织，保留完整的骨痂标本。取部分骨痂标本，加入pH 7.4 PBS，用匀浆器将标本匀浆充分，以3 000×g离心20 min，收集上清液。按ELISA试剂盒说明操作，在酶标包被板中分别加入9、6、3、1.5、0.75 ng/mL的标准品和各组大鼠骨痂标本，采用酶标仪测量不同浓度的标准品和各组大鼠骨痂标本在450 nm下光密度(optical density, OD)值。根据标准品的OD值，计算出标准品的直线回归方程，再根据各组大鼠骨痂样本的OD值，在标准直线回归方程上计算出各组大鼠骨痂标本的ALP浓度。

1.8　HE染色

取材部分骨痂标本，经4%多聚甲醛固定24 h，10%乙二胺四乙酸钠脱钙，逐级脱水、浸蜡，常规石蜡包埋，制成厚度为4 μm的石蜡切片。石蜡切片常规用二甲苯脱蜡、不同浓度乙醇脱水、HE染色，再次乙醇脱水、二甲苯透明、中性树脂封片。在光镜下观察切片的组织学特点。应用多功能真彩色细胞图象分析管理系统计量分析每张切片中骨组织的骨小梁表面成骨细胞指数(index of osteoblast, IOB)^[6]、骨小梁宽度(trabecular width, TW)、骨小梁面积百分比(trabecular volume，TV)，结果取各观察切片的平均值。

1.9　蛋白芯片检测

(1)芯片的制备：分别制作标准品点样矩阵与样品点样矩阵。样品点样矩阵中，分别将0.2 mg/mL的VEGF、IGF-1、BMP-2抗体与蛋白点样液按1∶1混合后进行点样，3种抗体，每种抗体重复两个点；另外设置阴性对照两个样点。点样后37 ℃进行干燥，抽真空塑封，4 ℃保存。

(2)标本的采集与处理：分别于术后2周及4周抽取各组大鼠股动脉血约2 mL，2 000×g离心20 min后，取血清置于4 ℃保存待检。

(3)检测步骤：检测时将芯片和标本从冰箱取出室温平衡20 min。将芯片放入芯片杂交盒中，在芯片杂交盒的两侧分别加入100 μL蒸馏水，保持湿度。每个样孔加入5%牛血清白蛋白30 μL室温下封闭30 min。标准品按说明稀释成不同的梯度在标准品芯片上进行点样，每个样孔加入50 μL。采用LuxScan™10k微阵列芯片扫描仪进行荧光检测，得出每个标准品样点的信号参数。

每组大鼠取50 μL血清样本，吸净芯片样孔中封闭液，在每个样孔加入样品血清。样品加样完毕后，将芯片杂交盒盖好放入BioMixer™Ⅱ三维旋转杂交仪上室温孵育1.5 h。吸净样孔中悬浮液，采用PBS加吐温20(PBS plus tween 20, PBST)在SlideWasher™8洗片仪进行洗片，洗涤5次，每次5 min。在样本矩阵中每个样孔分别加入50 μL的生物素标记的VEGF、IGF-1、BMP-2抗体，室温孵育1.5 h。吸净样孔中悬浮液，再次采用PBST在洗片仪进行洗片，洗涤5次，每次5 min。用含10%山羊血清的PBS将Cy3标记的链霉亲1∶50稀释，每个样孔加入稀释后Cy3标记的链霉亲和素50 μL室温下孵育1 h。再次应用PBST洗片5次，每次5 min后，利用干燥仪进行1 500×g离心10 min离心干燥。采用LuxScan™10k微阵列芯片扫描仪进行荧光检测，得出每个标本样点的信号参数。根据标准品的信号参数计算出标准品的直线回归方程式，在标准品的直线回归方程上，根据各组大鼠标本的信号参数计算出各组大鼠血清标本的VEGF、IGF-1、BMP-2抗体的浓度。

1.10　统计学方法

应用SPSS 21.0统计软件进行数据统计处理。服从或近似服从正态分布的计量资料以±s表示，多组间比较采用方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

48只大鼠，实验过程中一般情况良好，切口均愈合良好，无死亡。

2.1　骨折愈合情况

术后2周：对照组骨折线清晰可见，断端骨质边缘骨质密度减低。NGF组、BFGF组中骨折线较对照组模糊，断端骨质边缘密度减低，可见毛糙低密度影。NGF＋BFGF组骨折线较模糊，骨折间隙较其他3组小，断端骨质边缘毛糙，可见片状模糊高密度影。术后4周：各组大鼠骨折线均模糊，但对照组中骨痂密度稍低，骨折线较模糊。NGF组和BFGF组大鼠患肢骨折线基本消失，骨折断端局部变钝，可见外骨痂连接骨折两端。NGF＋BFGF组大鼠患肢骨折线消失，骨折断端可见大量梭行外骨痂影，甚至可见骨桥桥接骨折两端。见图1

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图1

大鼠胫骨骨折模型术后各组2周及4周时X线片　1A　对照组术后2周见断端骨质密度减低　1B　神经生长因子(NGF)组术后2周见断端有大量低密度新生骨填充　1C　碱性成纤维细胞生长因子(BFGF)组术后2周见断端骨质密度减低　1D　NGF＋BFGF组术后2周见骨折线较模糊，骨折间隙变小　1E　对照组术后4周见骨折线较模糊　1F　NGF组术后4周见骨折线基本消失，可见外骨痂连接骨折两端　1G　BFGF组术后4周见骨折线基本消失，骨折断端局部变钝　1H　NGF＋BFGF组术后4周见骨折线消失，可见骨桥桥接骨折两端

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图1

2.2　术后不同时间的ALP水平

4组大鼠组内比较显示，术后4周ALP含量均明显低于术后2周，差异均有统计学意义(P值均<0.05)。不同时间点4组间比较，对照组、NGF组、BFGF组、NGF＋BFGF组大鼠骨痂内ALP的含量均呈上升趋势，NGF＋BFGF组含量最高，组间两两比较，差异均有统计学意义(P值均<0.05)。见表1。

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表1

4组大鼠胫骨骨折模型术后不同时间骨痂中ALP含量比较(ng/mL，±s)

表1

4组大鼠胫骨骨折模型术后不同时间骨痂中ALP含量比较(ng/mL，±s)

组别	样本数	术后2周	术后4周
对照组	6	110.02±1.92	91.23±1.47
NGF组	6	140.87±2.22^a	106.62±1.64^a
BFGF组	6	136.12±1.23^ab	104.83±1.05^ab
NGF＋BFGF组	6	187.44±0.90^abc	130.59±1.18^abc
F值		303.814	874.66
P值		<0.01	<0.01

注：ALP为碱性磷酸酶；NGF为神经生长因子；BFGF为碱性成纤维细胞生长因子；与对照组比较，^aP<0.05；与NGF组比较，^bP<0.05；与BFGF组比较，^cP<0.05

2.3　术后不同时间骨折痂组织学观察

术后第2周：对照组大鼠骨痂及成纤维细胞明显少，骨折断端骨小梁形成少。NGF组、BFGF组大鼠骨折线内有骨痂充填，骨痂内有很多成纤维细胞，部分成纤维细胞沿骨小梁长轴排列，可见活跃增生的软骨细胞，并可见软骨内成骨及新生骨小梁、新生血管形成。NGF＋BFGF组大鼠骨折处混合软骨骨痂及纤维骨痂，新生骨小梁及血管较其他组明显；大量较成熟软骨存在，形成软骨岛，有较多骨小梁生成。

术后第4周：4组均可见大量骨痂生成，内有大量的成纤维细胞和较多的骨小梁，骨小梁形成较2周时均明显增多。对照组大鼠成骨细胞增生较2周时活跃，骨基质间有较多成纤维细胞，软骨骨痂相对增多，但成熟骨小梁仍较少。NGF组、BFGF组中骨小梁明显增厚，并见明显的软骨钙化，骨小梁增多并形成网状，多为编织骨，并向成熟板层骨转化。NGF＋BFGF组中骨小梁更为成熟，并可见更多成熟板层骨。见图2。

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图2

大鼠胫骨骨折模型术后各组2周及4周组织学观察(HE染色× 40) 　2A　对照组术后2周见骨痂及成纤维细胞形成少　2B　神经生长因子(NGF)组术后2周见成纤维细胞及活跃增生的软骨细胞　2C　碱性纤维细胞生长因子(BFGF)组术后2周见软骨内成骨及新生骨小梁、新生血管形成　2D　NGF＋BFGF组术后2周混合软骨骨痂及纤维骨痂，较成熟软骨存在　2E　对照组术后4周见较多成纤维细胞，软骨骨痂增多　2F　NGF组术后4周见骨小梁增多并形成网状，多为编织骨　2G　BFGF组术后4周见骨小梁增多并形成网状，多为编织骨　2H　NGF＋BFGF组术后4周见更多成熟板层骨

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图2

2.4　骨痂中骨小梁形态学指标测量结果

不同时间点4组间比较，对照组、NGF组、BFGF组、NGF＋BFGF组大鼠骨痂内骨小梁IOB、TW、TV均呈上升趋势，NGF＋BFGF组最高；组间两两比较，除NGF组与BFGF组各指标差异均无统计学意义(P值均>0.05)，其他不同组间各指标差异均有统计学意义(P值均<0.05)。见表2。

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表2

4组大鼠胫骨骨折模型术后不同时间骨痂组织骨小梁形态学测量结果比较(±s)

表2

4组大鼠胫骨骨折模型术后不同时间骨痂组织骨小梁形态学测量结果比较(±s)

组别	样本数	IOB(个/mm)
组别	样本数	术后2周	术后4周
对照组	6	277.05±1.99	220.43±2.32
NGF组	6	350.20±13.50^a	360.31±5.15^a
BFGF组	6	346.96±10.75^a	357.84±4.16^a
NGF＋BFGF组	6	386.15±1.28^abc	378.02±1.71^abc
F值		277.053	357.840
P值		<0.01	<0.01

组别	样本数	TW(μm)
组别	样本数	术后2周	术后4周
对照组	6	62.28±0.97	63.91±0.94
NGF组	6	75.23±2.12^a	79.09±0.58^a
BFGF组	6	74.27±1.07^a	78.46±0.73^a
NGF＋BFGF组	6	79.18±1.50^abc	83.36±0.77^abc
F值		80.181	69.525
P值		<0.01	<0.01

组别	样本数	TV(%)
组别	样本数	术后2周	术后4周
对照组	6	37.33±0.88	34.08±0.71
NGF组	6	47.09±1.54^a	45.80±0.37^a
BFGF组	6	45.40±2.13^a	46.40±0.42^a
NGF＋BFGF组	6	55.05±1.88^abc	51.30±0.87^abc
F值		45.398	52.291
P值		<0.01	<0.01

注：NGF为神经生长因子；BFGF为碱性成纤维细胞生长因子；IOB为成骨细胞指数；TW为骨小梁宽度；TV为骨小梁面积百分比；与对照组比较，^aP<0.05；与NGF组比较，^bP<0.05；与BFGF组比较，^cP<0.05

2.5　术后不同时间VEGF、BMP-2和IGF-1水平的比较

不同时间点4组间比较，除VEGF含量在术后4周时差异无统计学意义(P>0.05)，术后2周时VEGF及术后2周、4周时BMP-2、IGF-1，NGF组、BFGF组、NGF＋BFGF组均高于对照组，NGF＋BFGF组含量最高，组间两两比较，差异均有统计学意义(P值均<0.05)。见表3。

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表3

4组大鼠胫骨骨折模型术后不同时间点血清中VEGF、BMP-2、IGF-1的含量比较(pg/mL, ±s)

表3

4组大鼠胫骨骨折模型术后不同时间点血清中VEGF、BMP-2、IGF-1的含量比较(pg/mL, ±s)

组别	样本数	VEGF
组别	样本数	术后2周	术后4周
对照组	6	230.96±15.81	204.79±8.12
NGF组	6	350.20±13.50^a	360.31±5.15^a
BFGF组	6	346.96±10.75^ab	357.84±4.16^a
NGF＋BFGF组	6	386.15±1.28^abc	378.02±1.71^abc
F值		198.285	545.931
P值		<0.01	>0.05

组别	样本数	BMP-2
组别	样本数	术后2周	术后4周
对照组	6	98.80±3.87	90.63±2.10
NGF组	6	122.29±0.85^a	113.46±0.62^ab
BFGF组	6	119.20±0.69^ab	109.56±0.61^a
NGF＋BFGF组	6	131.45±0.57^abc	135.17±0.38^abc
F值		368.060	2 006.017
P值		<0.01	<0.01

组别	样本数	IGF-1
组别	样本数	术后2周	术后4周
对照组	6	298.05±15.76	286.88±8.38
NGF组	6	319.04±2.16^a	329.59±0.60^a
BFGF组	6	308.21±1.63^ab	311.48±1.24^ab
NGF＋BFGF组	6	336.22±0.32^abc	353.37±3.81^abc
F值		33.332	292.643
P值		<0.01	<0.01

注：NGF为神经生长因子；BFGF为碱性成纤维细胞生长因子；VEGF为血管内皮生长因子；BMP-2为骨形成蛋白-2；IGF-1为胰岛素样生长因子-1；与对照组比较，^aP<0.05；与NGF组比较，^bP<0.05；与BFGF组比较，^cP<0.05

3　讨论

3.1　骨不连治疗的研究现状

骨折愈合是一个复杂且有序的级联反应，是机体神经因素、体液因素及机械等因素共同作用及参与下的结果。临床通常将超过9个月骨折端仍未达到骨性连接者称为骨不连，而骨不连的治疗仍是临床工作中的一大难题。目前，治疗骨不连较常用的方法仍是手术治疗为主，松质骨移植及内固定是治疗的主要方法，但无论是自体骨移植还是异体骨移植都存在一定的缺陷。随着人们对骨愈合分子机制深入研究，骨不连的临床干预策略也在慢慢发生相应变化，如干细胞移植的治疗技术，富血小板血浆的应用，组织工程学修复缺损组织的应用也越来越多被用于骨不连的实验研究中。而近年来生物技术的飞速发展使得在骨折局部人工添加生长因子成为可能，更重要的是通过局部注射各种生长因子的方法，具有操作简单、创伤轻微、依从性较好的优点，易于在临床推广使用。Cao等^[7]研究发现，在新西兰白兔骨折断端局部注射治疗NGF，骨痂生成量明显增多，骨痂刚度和抗折弯强度也显著增加。唐列云和何爱咏^[8]通过兔子桡骨骨折模型实验研究证实，BFGF在动物体内骨缺损局部应用显示良好的成骨作用。而对于两者联合应用是否可以对骨折愈合起协同或加强作用尚无相关文献报道。

3.2　NGF及BFGF促进骨折愈合的机制

自1960年Gibson首次报道了骨折合并脑外伤时有大量骨痂形成的现象以来，国内外大量学者对骨折合并脑外伤时骨折愈合加速的机制进行了研究，结果显示脑外伤后血清及脑脊液中一些成骨因子的含量升高，参与了加速骨折愈合的过程^[9]。这些成骨因子包括NGF、BFGF、BMP、血小板衍生生长因子、VEGF、IGF等。其中NGF是一种多肽蛋白，广泛存在于动物器官的多种蛋白质中，是一种可促进神经突起生成的神经营养因子。NGF是一个重要的神经肽信号，能诱导BMSC神经分化，调节细胞增殖和细胞存活生长^[10]。Lundberg等^[11]发现神经系统同时具有调节骨组织生长发育的能力。Cramer等^[12]研究发现，在再生轴突周围有新生类骨质生成。但Wang等^[13]和Navarro等^[14]研究显示，在一些骨不连以及异位骨化的骨组织中缺少甚至是不出现神经纤维的长入。Zhuang和Li^[15]研究发现，骨折合并脑外伤患者血清中NGF浓度增高，骨折愈合加速，提示NGF可能是促进骨折加速愈合的重要原因之一。而且，NGF可以促进骨组织软骨化和血管化的过程，加速骨折愈合的早期软骨矿化，同时其能通过增加COL2A1 mRNA和SOX9 mRNA的表达，促进软骨分化，增加破骨细胞的形成^[16]。多项研究显示，NGF可促进骨折愈合过程中VEGF、BMP、IGF等多种细胞因子的表达而促进骨折愈合^[3,4,17]。

BFGF是一种功能强大的有丝分裂原，能够促进细胞增殖和有丝分裂，能促进神经轴突再生^[18]、神经干细胞和前体细胞的营养及生长；还能促进中胚层和神经外胚层细胞分裂，可通过诱导多种基因的表达以及促进多种细胞的增值而促进骨折愈合^[19]。顾雄华等^[20]通过兔桡骨骨折断端局部注射BFGF研究发现，BFGF对骨折愈合有促进作用。Yoon等^[21]研究显示，BFGF能诱导骨折愈合过程中成骨的活性，促进透明软骨的生成，并对血管形成的多个环节有促进作用。有研究显示，在骨折合并脑外伤的患者血清中BFGF浓度增高，骨折愈合加速^[22]。还有研究结果提示，BFGF可能是促进骨折加速愈合的重要原因之一^[23]。近年来的研究证实，BFGF和纤维蛋白胶可以较好地结合，发挥促进成骨的良好作用^[19]。另一项研究也证实，骨折愈合过程中，通过骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)诱导BFGF过表达，能刺激血管生成，促进MSCs向成骨细胞分化，形成新骨，加速骨折修复^[23]。

ALP是一种含锌的糖蛋白，一般认为ALP参与成骨作用。当骨骼损伤时，机体的成骨细胞活动增加，使成骨细胞内所含高浓度的ALP释放进入血液中，引起血清ALP活性增高。ALP作为成骨标志物之一，在成骨活动中起着重要重要，其活性反映了骨转化的速率，因此血清中ALP的水平可反映骨折愈合的能力。本实验将ALP检测作为评价骨折预后的重要指标，对骨折愈合做出早期简单、快捷、准确的判断。

本研究结果显示：NGF组、BFGF组术后2、4周VEGF、BMP及IGF的表达量，骨痂中ALP含量及骨小梁IOB、TW、TV检查结果均高于对照组，结合X线检查结果，提示NGF、BFGF促进骨折愈合。笔者分析，骨折愈合过程中BMP表达增高，可诱导间充质细胞向软骨和骨细胞分化，并与成骨细胞膜上的受体结合，促使成骨活性增强；VEGF表达增高，可刺激了血管生成，加速血管化进程；IGF的持续高表达，可加强成骨细胞功能的调节作用，促使成骨细胞和骨髓基质细胞向血管内皮细胞分化，并增加骨质沉积，促进骨基质合成钙化，从而促进骨折愈合。

3.3　NGF、BFGF联合应用的可行性

国外研究发现，NGF、BFGF的双基因修饰能促进大鼠骨髓MSCs在体外分化为神经元样细胞，NGF和BFGF共转染骨髓MSCs可使细胞外信号调控激酶磷酸化表达增加，且细胞中磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)表达水平升高，提示AKT通路也参与其中，促进神经元增长分化^[24]。而活化的AKT通路在骨折愈合过程中可能起一个重要作用，其可以抑制Runx2表达进而调控骨的形成。由此推断两者的联合应用可能对骨折愈合过程起到重要的影响。本研究结果显示：NGF＋BFGF组术后2、4周VEGF、BMP及IGF的表达量，骨痂中ALP含量及骨小梁IOB、TW、TV检查结果均高于对照组，也高于NGF组和BFGF组，结合X线检查结果，提示两者联合应用不仅能促进大鼠胫骨骨折愈合，而且两者联合较单独应用，成骨作用更强，两者间可能存在协同作用。

3.4　蛋白芯片技术的应用价值

蛋白芯片技术是一种通过靶分子和捕捉分子的相互作用来监测蛋白分子间相互作用的技术。传统的检测方法仅能对骨折愈合时单一细胞因子进行检测，不适于同时进行大规模、多因子联合检测分析。而蛋白芯片技术可以准确、快速实现在骨折愈合过程中多因子及蛋白等大信息量的检测。从而更充分地阐明骨折愈合过程中各种细胞因子之间的相互联系，以便更好地探究骨折愈合加速的相关机制，是一种强而有力的高通量研究方法^[25]。但是，蛋白芯片技术也有着自己的特殊性：蛋白质的化学性质及空间结构均十分复杂，受环境影响容易变性，抗原抗体的亲和反应其特异性及亲和力有限，且蛋白质来源有限，不能大量人工合成。因此，制作蛋白芯片时必须在一个含有较大量结合蛋白，同时对蛋白活性影响较小的固定表面进行，以保证其可靠性及高效性。而在本研究中，通过使用小量样品的血样标本，在应用蛋白芯片技术下同时完成了对骨折愈合过程中BMP、VEGF、IGF多种因子的检测。

3.5　研究的意义及局限性

本研究为骨折断端局部注射NGF及BFGF的临床应用提供理论依据，并通过研究多因子联合应用的协同作用，为临床治疗骨折延迟愈合及骨不连患者提供了实验参考，从而为临床上经皮局部注射生长因子这一微创治疗技术的应用提供理论指导。由于本研究样本数相对较少，观察时间较短，以及对两者之间协同作用的机制仍需进一步深入研究。在今后尚需加大样本，并在ERK通路及AKT通路等传导通路及相关基因层面进行深入研究。

利益冲突

利益冲突　所有作者均声明不存在利益冲突

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贡献者信息

袁鹤

河北医科大学第二医院骨外科，石家庄　050000

童九辉

河北医科大学第二医院骨外科，石家庄　050000

王斌

河北医科大学第二医院骨外科，石家庄　050000

马维

河北医科大学第二医院骨外科，石家庄　050000

通信作者

马维

河北医科大学第二医院骨外科，石家庄　050000

Email：15803210539@163.com

关键词

骨折愈合; 骨痂; 大鼠; 胫骨骨折; 神经生长因子; 碱性成纤维生长因子; 局部注射; 蛋白芯片;

利益冲突

利益冲突　所有作者均声明不存在利益冲突

历史

出版日期：2020-02-06

收稿日期：2019-01-18

本文编辑

刘宏莉

Experimental Research

Effect of local injection of nerve growth factor and basic fibroblast growth factor on the healing of tibial fracture in rats

Yuan He, Tong Jiuhui, Wang Bin, Ma Wei

Published 2020-02-06

Cite as Chin J Anat Clin, 2020,25(01): 74-81. DOI: 10.3760/cma.j.issn.2095-7041.2020.01.013

Abstract

Objective

To investigate the effects and mechanism of local injection of nerve growth factor (NGF) and basic fibroblast growth factor (BFGF) on tibial fracture healing in rats.

Methods

Forty-eight clean mature male SD rats were randomly divided into four groups: NGF group, BFGF group, NGF+ BFGF group and control group. Each group was randomly divided into two subgroups (2 weeks after operation and 4 weeks after operation) according to different observation time points, six rats in each subgroup. The left tibial fracture model was established in 48 rats, and intramedullary fixation with 1 mm Kirschner wire was performed. On the third day after surgery, local percutaneous injection was given around the fracture end. The NGF group was injected with 0.8 μg+ 0.3 mL normal saline, the BFGF group received local injection of BFGF 1.2 μg + 0.3 mL normal saline, the NGF+ BFGF group received local injection of NGF 0.8 μg+ BFGF 1.2 μg+ 0.3 mL normal saline, and the control group received 0.3 mL normal saline. Each group was injected once a day for 7 consecutive days.X-ray films were taken at 2 weeks and 4 weeks after the operation, and blood samples of femoral artery of rats in each group were taken, then the rats were killed by cervical vertebra disconnection.The content of alkaline phosphatase (ALP) was detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The callus tissue was made into pathological sections, and HE staining was performed to observe the histological characteristics. Osteoblastic index (IOB), trabecular width (TW) and trabecular area percentage (TV) of bone tissue were calculated by multifunctional true-color cell image analysis and management system. The contents of bone morphogenetic protein-2 (BMP-2), vascular endothelial growth factor (VEGF) and insulin-like growth factor-1 (IGF-1) in serum of rats were detected by protein chip technique.

Results

(1) X-ray film: the fracture healing of NGF, BFGF and NGF+ BFGF group was faster than that of the control group, and that of NGF+ BFGF group was the fastest. (2) ELISA: the content of ALP at 2 weeks after surgery in the callus of the control group, NGF group, BFGF group and NGF+ BFGF group were(110.02±1.92), (140.87±2.22), (136.12±1.23) and (187.44±0.90)ng/mL, respectively. The ALP contents in callus were (91.23±1.47), (106.62±1.64), (104.83±1.05) and (130.59±1.18)ng/mL, respectively, at 4 weeks after surgery. The content of ALP in the callus of the NGF+ BFGF group was the highest, and the difference between the groups was statistically significant (all P values<0.05). (3) HE staining: histological observation showed that the growth of callus and the formation of trabecula in NGF, BFGF and NGF+ BFGF groups were significantly higher than those in the control group at different time points, and NGF+ BFGF group was superior to other groups. The morphological indexes of bone trabeculae showed that compared with the four groups at different time points, IOB, TW and TV of bone trabeculae in the control group, NGF group, BFGF group and NGF+ BFGF group all showed an increasing trend, and the NGF+ BFGF group had the highest values. Pairwise comparison between the two groups showed no statistical significance in all indicators except NGF group and BFGF group (all P values>0.05), and all other indicators had statistical significance between the two groups (all P values<0.05). (4) Protein chip detection: compared between the four groups at different time points, except for VEGF content, there was no statistically significant difference at 4 weeks after surgery (P>0.05). The VEGF content at 2 weeks after surgery, and the BMP-2 and IGF-1 content at 2 weeks and 4 weeks after surgery of NGF group, BFGF group and NGF+ BFGF group were all higher than those of the control group, and the content of NGF+ BFGF group was the highest. Pairwise comparison between groups showed statistically significant differences (F=198.285, 368.060, 2 006.017, 33.332, 292.643, all P values<0.05).

Conclusions

Both NGF and BFGF can promote the healing of tibial fracture in rats, and the combination of them has synergistic effects. The mechanism may be related to the better promotion of VEGF, BMP-2 and IGF-1 expression in the process of fracture healing.

Key words:

Fracture healing; Bony callus; Rats; Tibial fractures; Nerve growth factor; Basic fibroblast grouth factor; Local injection; Protein chip

Contributor Information

Yuan He

Department of Orthopaedics, the Second Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050000, China

Tong Jiuhui

Wang Bin

Ma Wei

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