探讨乳腺癌组织中高迁移率族蛋白B1(HMGB1)和表皮生长因子受体1(EGFR)的表达情况、相关性，及其对患者预后的影响。
纳入2007年1月—2018年12月东阳市人民医院病理科浸润性乳腺癌石蜡标本392例。患者均为女性；年龄26～90岁，中位年龄52岁。采用免疫组织化学EnVision法，检测标本中HMGB1蛋白在细胞核、细胞质的表达情况以及EGFR蛋白在细胞膜的表达情况，分析HMGB1蛋白与EGFR蛋白表达的相关性。根据HMGB1蛋白在细胞核及细胞质表达状态分为细胞核低表达且细胞质阴性组、细胞核高表达且细胞质阴性组、细胞核低表达且细胞质阳性组、细胞核高表达且细胞质阳性组，比较4组间EGFR蛋白的表达情况。分别观察细胞核HMGB1蛋白高表达＋EGFR蛋白阳性、细胞质HMGB1蛋白阳性＋EGFR蛋白阳性时对患者预后的影响。
(1)乳腺癌中，HMGB1蛋白在细胞核和细胞质阳性表达率分别为80.1%(314/392)和15.1%(59/392)，EGFR蛋白在细胞膜阳性表达率为53.6%(210/392)。(2)细胞核HMGB1蛋白高表达患者的EGFR蛋白阳性率56.1%(176/314)，高于细胞核HMGB1蛋白低表达的EGFR蛋白阳性率43.6%(34/78)，差异有统计学意义(χ2＝3.901, P<0.05)；Spearman相关分析显示细胞核HMGB1蛋白高表达和EGFR蛋白阳性呈正相关(r＝0.100, P<0.05)。细胞质HMGB1蛋白阳性患者的EGFR蛋白阳性率(66.1%，39/59)，高于细胞质HMGB1蛋白阴性的EGFR蛋白阳性率(51.4%，171/333)，差异有统计学意义(χ2＝4.384, P<0.05)；Spearman相关分析显示细胞质HMGB1蛋白阳性和EGFR蛋白阳性表达亦呈正相关(r＝0.106, P<0.05)。(3)HMGB1蛋白细胞核低表达且细胞质阴性68例、细胞核高表达且细胞质阴性265例、细胞核低表达且细胞质阳性10例、细胞核高表达且细胞质阳性49例，4组中EGFR蛋白阳性率分别为42.6%(29/68)、53.6%(142/265)、50.0%(5/10)、69.4%(34/49)，组间比较差异有统计学意义(χ2＝8.242, P<0.05)。(4)392例乳腺癌病例中，235例获得了预后生存分析资料。患者术后随访时间为3～80个月，平均60个月。生存分析显示，在235例患者中，5年累积生存率为90.6%，5年无复发累积生存率为81.3%。细胞核HMGB1蛋白高表达且EGFR阳性的患者5年无复发累积生存率为75.2%，低于其他患者的85.8%，差异有统计学意义(χ2＝4.171、P<0.05)。细胞核HMGB1蛋白高表达＋EGFR阳性的患者5年累积生存率为89.1%，与其他患者的91.8%比较，差异无统计学意义(χ2＝0.557、P>0.05)。细胞质HMGB1蛋白阳性＋EGFR阳性的患者5年无复发累积生存率为72.2%，5年累积生存率为83.3%，分别低于其他患者的82.0%、91.2%，但差异均无统计学意义(χ2＝1.070、1.307，P值均>0.05)。
细胞核及细胞质HMGB1蛋白的表达均与EGFR蛋白表达正相关，并且细胞核或细胞质HMGB1蛋白与EGFR蛋白同时高表达的患者有更低的5年无复发累积生存率和5年累积生存率。同时抑制HMGB1和EGFR可能成为抗乳腺癌治疗的新策略。
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乳腺癌是全球女性最常见的恶性肿瘤之一，其发病率位于女性恶性肿瘤首位[1,2]。高迁移率族蛋白B1(high mobility group box protein B1，HMGBl)是一种真核生物细胞内的非组蛋白染色体结合蛋白，其在炎症反应、免疫反应、恶性肿瘤进展等多种生物学过程中发挥重要作用[3,4,5,6,7,8]。HMGBl在细胞核内和细胞核外发挥不同的生物学功能：在细胞核内，参与转录调控、DNA重组和修复、维持和稳定核小体结构等功能；而在细胞核外，参与炎症免疫反应、细胞分化、增殖、迁移等[3]。人表皮生长因子受体1(epidermal growth factor receptor, EGFR)是促肿瘤发生及进展的重要因子，在多种肿瘤侵袭转移过程中发挥重要作用[9,10,11,12,13,14,15,16,17,18]。本课题组前期研究结果表明，乳腺癌中EGFR通过下游p44/p42丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号通路正性调控细胞骨架蛋白成束蛋白1(Fascin-1)的表达，进而影响癌细胞侵袭迁移[19]。同时，国外有研究显示HMGB1通过激活下游p44/p42 MAPK通路促进肿瘤细胞增殖、侵袭[20]。因此，在本研究中，我们收集了392例浸润性乳腺癌组织，探讨乳腺癌中HMGB1和EGFR表达的相关性，以及HMGB1与EGFR共同表达对患者预后的影响，以期为乳腺癌的临床治疗提供分子学理论基础。
纳入标准：(1)经手术病理诊断为浸润性乳腺癌的患者；(2)临床病理学资料完整。排除标准：术前经化疗、免疫及放射等抗肿瘤治疗。
纳入2007年1月—2018年12月东阳市人民医院病理科浸润性乳腺癌石蜡标本392例。患者均为女性；年龄26～90岁，中位年龄52岁。肿瘤长径：<2 cm 178例，2～5 cm 194例，>5 cm 20例。淋巴结转移阴性197例，阳性195例。组织学分级：Ⅰ级20例，Ⅱ级264例，Ⅲ级108例；pTNM分期：Ⅰ期105例，Ⅱ期190例，Ⅲ期97例。本研究经东阳市人民医院医学伦理委员会批准(东人医2018-YX-054)。
免疫组化EnVision试剂盒及二氨基联苯胺(diaminobenzidine，DAB)显色试剂盒购自丹麦Dako公司，兔抗人HMGB1单克隆抗体购自英国Abcam公司，兔抗人EGFR多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司。
手术切除标本以10%甲醛溶液固定，经常规脱水、透明、浸蜡、包埋，石蜡标本连续切片，切片厚度3～4 μm。石蜡切片经烤片、脱蜡、梯度酒精水化及柠檬酸盐缓冲液高压热修复后，滴加兔抗人HMGB1单克隆一抗(1∶100稀释)及兔抗人EGFR多克隆一抗(1∶100稀释)，室温孵育70 min；滴加即用型二抗，室温孵育50 min；DAB显色3～8 min，苏木素复染后，经乙醇脱水、二甲苯透明后，中性树脂封片。
HMGBl蛋白染色定位于细胞核和细胞质，评分标准[21]：无染色0分、淡黄色1分、棕黄色2分、棕褐色3分。在细胞核中，以0、1分为低表达，2、3分为高表达；在细胞质中，以0分为阴性，1～3分为阳性。
EGFR染色主要定位于细胞膜，评分标准[19]：≥10%肿瘤细胞可见弱(淡黄色)到强(棕褐色)的胞膜着色视为阳性，否则为阴性。
结果评判由两位高年资病理医师独立完成，两人意见不一致时由第三位高年资病理医师评判并确定结果。
(1)观察细胞核、细胞质HMGB1蛋白和细胞膜EGFR蛋白的表达情况，并分析HMGB1蛋白与EGFR蛋白表达的相关性。(2)根据HMGB1蛋白在细胞核及细胞质表达状态将病例分为细胞核低表达且细胞质阴性组、细胞核高表达且细胞质阴性组、细胞核低表达且细胞质阳性组、细胞核高表达且细胞质阳性组，观察4组间EGFR蛋白的表达情况。(3)分析细胞核HMGB1蛋白高表达＋EGFR蛋白阳性、细胞质HMGB1蛋白阳性＋EGFR蛋白阳性时对患者预后的影响。
患者在手术后，每半年复查1次，观察临床症状，并进行影像学和血液肿瘤指标检查，观察患者乳腺癌局部复发情况，以及患者的5年累积生存率和5年无复发累积生存率。
应用SPSS 19.0统计软件处理数据。不同HMGB1蛋白表达组之间EGFR蛋白表达差异分析采用χ2检验。HMGB1蛋白与EGFR蛋白的相关性采用Spearman相关分析。采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，用log-rank检验进行生存分析。以P<0.05为差异有统计学意义。
在392例乳腺癌组织中，HMGB1蛋白在细胞核中高表达314例、低表达78例，在细胞质中阳性表达59例、阴性表达333例；EGFR蛋白在细胞膜中阳性表达210例，阴性表达182例。见表1、图1。
注：HMGB1为高迁移率族蛋白B1；EGFR为表皮生长因子受体1
乳腺癌组织中HMGB1和EGFR蛋白表达的比较(例)
乳腺癌组织中HMGB1和EGFR蛋白表达的比较(例)
| HMGB1表达 | 例数 | EGFR表达 | χ2值 | P值 | ||
|---|---|---|---|---|---|---|
| 阴性 | 阳性 | |||||
| 细胞核 | ||||||
| 低表达 | 78 | 44 | 34 | 3.901 | <0.05 | |
| 高表达 | 314 | 138 | 176 | |||
| 细胞质 | ||||||
| 阴性 | 333 | 162 | 171 | 4.384 | <0.05 | |
| 阳性 | 59 | 20 | 39 | |||
| 细胞核及细胞质表达 | ||||||
| 细胞核低表达且细胞质阴性 | 68 | 39 | 29 | 8.242 | <0.05 | |
| 细胞核高表达且细胞质阴性 | 265 | 123 | 142 | |||
| 细胞核低表达且细胞质阳性 | 10 | 5 | 5 | |||
| 细胞核高表达且细胞质阳性 | 49 | 15 | 34a | |||
注：HMGB1为高迁移率族蛋白B1；EGFR为表皮生长因子受体1；与细胞核低表达/细胞质阴性比较，aP<0.05
细胞核HMGB1蛋白高表达患者的EGFR蛋白阳性率，高于细胞核HMGB1蛋白低表达的EGFR蛋白阳性率，差异有统计学意义(P<0.05)；Spearman相关分析显示细胞核HMGB1蛋白高表达和EGFR蛋白阳性呈正相关(r＝0.100, P<0.05)。细胞质HMGB1蛋白阳性患者的EGFR蛋白阳性率，高于细胞质HMGB1蛋白阴性的EGFR蛋白阳性率，差异有统计学意义(P<0.05)；Spearman相关分析显示细胞质HMGB1蛋白阳性和EGFR蛋白阳性表达亦呈正相关(r＝0.106, P<0.05)。根据HMGB1蛋白在细胞核及细胞质表达状态分为4组，4组间EGFR蛋白阳性率比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。
在392例乳腺癌病例中，235例获得了预后生存分析资料。患者术后随访时间为3～80个月，平均60个月。生存分析显示，在235例患者中，5年累积生存率为90.6%，5年无复发累积生存率为81.3%。
细胞核HMGB1蛋白高表达＋EGFR阳性的患者5年无复发累积生存率为75.2%，低于其他患者的85.8%，差异有统计学意义(χ2＝4.171, P<0.05)。见图2A。细胞核HMGB1蛋白高表达＋EGFR阳性的患者5年累积生存率为89.1%，与其他患者的91.8%比较，差异无统计学意义(χ2＝0.557、P>0.05)。见图2B。
注：HMGB1为高迁移率族蛋白B1；EGFR为表皮生长因子受体1
细胞质HMGB1蛋白阳性＋EGFR阳性的患者5年无复发累积生存率为13/18，5年累积生存率为15/18，分别与其他患者的82.0%、91.2%比较，差异均无统计学意义(χ2＝1.070、1.307, P值均>0.05)。见图2C、图2D。
研究显示，HMGB1与肝癌、乳腺癌、结直肠癌等多种恶性肿瘤的发生、进展密切相关，可通过影响下游一系列信号传导通路来影响肿瘤细胞增殖、侵袭和迁移[4,5,6,7,8]。细胞核内的HMGBl可通过主动分泌或被动释放等形式分泌到胞外[3,4,5]，其主动分泌过程需细胞核HMGB1经乙酰化、磷酸化等转录，再经表观遗传修饰后，转位至细胞质中，然后进入分泌性溶酶体中以出胞方式到胞外[3,4,5]。细胞核中和细胞核外的HMGB1发挥了不同的生物学功能[3]。本课题组在前期研究中发现，HMGB1基因中rs1360485、rs2249825和rs1412125等多个单核苷酸多态性位点的变异与乳腺癌发生和进展相关[6]。因此，HMGB1在乳腺癌发生和进展中发挥了重要作用。然而，HMGB1是通过什么途径来影响乳腺癌的发生和进展的，以及不同亚细胞定位的HMGB1信号传导机制的异同，目前尚不明确。EGFR是表皮生长因子受体家族的重要成员，是一种公认的促癌基因，那么，乳腺癌中HMGB1和EGFR信号通路之间是否存在某种关联，目前尚未见相关报道。
本研究结果显示在，HMGB1蛋白细胞核高表达和细胞质阳性的乳腺癌病例中，EGFR蛋白阳性率均显著增强，并且HMGB1蛋白细胞核高表达和细胞质阳性表达均与EGFR蛋白阳性表达呈正性相关。由于HMGBl是一种非组蛋白染色体结合蛋白，其在核内参与了基因转录调控等功能[3]；因此，我们认为，乳腺癌中细胞核HMGB1蛋白可能通过直接或间接方式影响EGFR的表达。同时，本研究结果还显示，细胞核和细胞质HMGB1蛋白表达水平越高，EGFR蛋白阳性率就越高，提示细胞核HMGB1蛋白表达与细胞质HMGB1蛋白表达对EGFR蛋白表达的影响存在一定的协同作用；细胞核HMGB1蛋白高表达且EGFR阳性的患者，其5年无复发累积生存率显著低于其他患者，提示它们共同表达患者的预后差于其他患者。而细胞质HMGB1蛋白阳性＋EGFR阳性的患者5年无复发累积生存率及累积生存率与其他患者比较，差异均无统计学意义。笔者分析，可能与细胞质HMGB1蛋白阳性且EGFR阳性患者的病例数过少有关。因此，今后仍有待扩大样本量进一步研究。
综上所述，乳腺癌中HMGB1和EGFR存在正相关关系，HMGB1可能正性调控EGFR，并进一步影响下游信号通路，引起乳腺癌的发生发展，并且它们同时表达与患者预后不良密切相关。该结果提示，联合抑制HMGB1和EGFR有望成为抗乳腺癌治疗的一种新的策略，为今后治疗提供了分子理论基础。然而，关于HMGB1对EGFR的具体调控机制，及不同亚细胞定位(细胞核及细胞质)HMGB1信号传导通路的差异和它们如何协同调控EGFR表达的机制，有待进一步探索。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
