探讨磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)-蛋白激酶B(AKT)-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路对骨肉瘤细胞顺铂耐药性的影响及其机制，为骨肉瘤的靶向治疗提供新的思路。
体外培养MG-63细胞，予2 μg/mL顺铂重复给药建立MG-63耐药细胞株，向MG-63耐药细胞株中转染miRNA-22高表达质粒建立miRNA-22高表达的MG-63耐药细胞株。以MG-63细胞为对照组，MG-63耐药细胞为耐药组，用2 μg/mL顺铂处理后的MG-63耐药细胞和转染miRNA-22的MG-63耐药细胞分别为耐药DDP组、耐药miRNA-22＋DDP组。采用噻唑兰(MTT)法检测细胞增殖能力。采用荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测细胞内PI3K、AKT以及mTOR mRNA的表达。采用Western blot检测细胞内PI3K、AKT以及mTOR蛋白的表达。
(1)MTT法检测结果显示，对照组、耐药组、耐药DDP组和耐药miRNA-22＋DDP组的吸光度分别为1.097±0.039、1.157±0.065、0.870±0.014和0.737±0.029，差异有统计学意义(F＝67.731，P<0.01)：与对照组比较，耐药DDP组、耐药miRNA-22＋DDP组吸光度均明显下降，差异均有统计学意义(P值均<0.01)；耐药组、耐药DDP组、耐药miRNA-22＋DDP组3组间比较，吸光度呈下降趋势，差异均有统计学意义(P值均<0.01)。(2)荧光定量RT-PCR结果显示，与对照组比较，耐药组、耐药DDP组PI3K、AKT的相对表达量均增多，尤其以耐药组增多明显(P值均<0.01)，耐药miRNA-22＋DDP组与对照组差异均无统计学意义(P值均>0.01)；而mTOR相对表达量耐药组增高，耐药DDP组、耐药miRNA-22＋DDP组均降低，差异均有统计学意义(P值均<0.01)。耐药DDP组、耐药miRNA-22＋DDP组PI3K、AKT、mTOR的相对表达量均低于耐药组，差异均有统计学意义(P值均<0.01)；而耐药miRNA-22＋DDP组仅PI3K、mTOR的相对表达量低于耐药DDP组，差异均有统计学意义(P值均<0.01)。(3)Western blot检测结果显示，与对照组比较，耐药组PI3K、AKT、mTOR蛋白的相对表达量均明显增加，耐药DDP组、耐药miRNA-22＋DDP组PI3K、AKT蛋白的相对表达量均明显降低，差异均有统计学意义(P值均<0.01)。耐药组、耐药DDP组、耐药miRNA-22＋DDP组3组间两两比较，耐药DDP组、耐药miRNA-22＋DDP组PI3K、AKT、mTOR蛋白的相对表达量均明显低于耐药组，耐药miRNA-22＋DDP组PI3K、AKT蛋白的相对表达量均明显低于耐药DDP组，差异均有统计学意义(P值均<0.01)。
PI3K-AKT-mTOR通路参与了骨肉瘤细胞对顺铂耐药性的产生，miRNA-22通过下调PI3K-AKT-mTOR通路中PI3K、AKT以及mTOR的表达降低骨肉瘤细胞对顺铂的耐药性。
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骨肉瘤是青少年常见的原发恶性骨肿瘤，截肢术曾是骨肉瘤首选治疗手段。随着化疗联合保肢手术技术的发展，骨肉瘤患者5年生存率明显提高。然而，部分患者因耐药而对化疗敏感性减低，最终导致治疗效果的不满意，因此，骨肉瘤细胞的药物敏感性对其治疗、预后产生重要影响。当前，越来越多的证据支持微小RNA(microRNA，miRNA)在骨肉瘤的发生、发展、转移等过程中起着重要的作用[1]。我们的前期研究结果已证实，miRNA-22通过靶向调控异黏蛋白表达可增强骨肉瘤细胞对化疗的敏感性，抑制骨肉瘤细胞的增殖[2]。
磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase, PI3K)-蛋白激酶B(protein kinase B, AKT)-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)信号通路广泛存在于细胞中，在细胞的蛋白合成、生长、转移等方面起着重要调节作用。其功能异常与多种疾病的发生相关，包括乳腺癌、肝细胞癌、肺癌及骨肿瘤等[3]。Ma等[4]研究发现，PI3K-AKT-mTOR信号通路在骨肉瘤细胞中异常激活，促进骨肉瘤细胞生长和血管新生，从而降低瘤细胞对化疗药物的敏感性。本研究探讨PI3K-AKT-mTOR通路是否参与了骨肉瘤顺铂耐药性的产生，以及miRNA-22是否通过该通路增强顺铂的抗肿瘤作用，进而为骨肉瘤的治疗开拓新的途径。
MG-63细胞系购自中国科学院细胞库。TAKARA PrimeScript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒、SYBR® Premix Ex Taq试剂盒购自日本Takara公司，Lipofectamine™3000购自美国invitrogen公司，顺铂购自美国Sigma公司，AKT、mTOR蛋白抗体购自于Proteintech中国公司，PI3K蛋白抗体购自于艾博抗(上海)贸易有限公司，miRNA-22质粒购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司，荧光酶标仪微孔板检测系统Spectra Max M5e购自美国Molecular Devices公司，Tanon 5200化学发光检测系统、ECL发光液购自中国上海天能科技有限公司，ABI 7500 Fast荧光定量PCR仪购自美国Life Technologies公司，NanoDrop 2000C分光光度计购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司。
MG-63细胞加入含10%胎牛血清、青霉素、链霉素的DMEM培养基(标准培养基)，在5% CO2、37 ℃的细胞培养箱中培养。细胞融合度达70%～80%时，更换含有2 μg/mL顺铂的DMEM培养基继续培养24 h，如果贴壁细胞大于90%，提示MG-63耐药细胞株培养成功[5]；否则更换标准培养基按上述步骤继续培养，直至达到耐药细胞株培养标准。
取MG-63耐药细胞接种至6孔板，加入标准培养基，在5% CO2、37℃的细胞培养箱中进行培养，待细胞融合度达70%～80%时更换标准培养基，进行转染。分别用125 μL Opti-MEM培养基稀释2.5 μg miRNA-22质粒和3.75 μL Lipofectamine™ 3000，将稀释后的miRNA-22质粒加入稀释后的Lipofectamine™ 3000溶液，充分混匀，孵育5 min。将上述混合溶液加入6孔板，在5% CO2、37 ℃的细胞培养箱中继续培养72 h，即为miRNA-22高表达的MG-63耐药细胞[2]。miRNA-22质粒序列：正向引物5’-AAGCUGCCAGUUGAAGAACUGU-3’；反向引物5’-AGUUCUUCAACUGGCAGCUUUU-3’。
分别取MG-63细胞(对照组)、MG-63顺铂耐药细胞(耐药组)，在标准培养基中进行培养，待细胞全部贴壁，用胰酶消化，离心半径8 cm、1 000 r/min离心5 min，去除上清液，加入标准培养基重悬细胞，分别接种于6孔板，每孔5 000个细胞，每组3个复孔。
取MG-63顺铂耐药细胞和转染miRNA-22后的MG-63顺铂耐药细胞，在完成下列处理后分别纳入耐药DDP组和耐药miRNA-22＋DDP组：在标准培养基中培养至细胞融合度达70%～80%时，更换含2 μg/mL顺铂的DMEM培养基继续培养24 h，用胰酶消化，离心半径8 cm、1 000 r/min离心5 min，去除上清液，加入标准培养基重悬细胞，分别接种于6孔板上，每孔种5 000个细胞，每组3个复孔。
取接种于6孔板的4组细胞，在5% CO2、37 ℃细胞培养箱中继续培养24 h，分别向每孔加入10 μL MTT(5 mg/mL)，在细胞培养箱中继续培养3 h。去除培养基，每孔加入150 μL二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)，摇晃均匀，在570 nm波长测定吸光度。实验重复3次，结果取平均值。吸光度越高表示细胞增殖能力越高。
取接种于6孔板的4组细胞，在5% CO2、37 ℃细胞培养箱中继续培养至细胞融合度达80%～90%时，弃培养基，每孔加入1 mL trizol，室温放置2 min后转移至无RNA酶的离心管中，加入氯仿200 μL，震荡15 min，室温静置15 min，4 ℃、离心半径8 cm、12 000 r/min离心15 min。吸取上层液体移入新的离心管中，加入等体积异丙醇，混匀后室温静置5 min，4 ℃、离心半径8 cm、12 000 r/min离心5 min。去上清液，加入75%乙醇1 mL，轻微振荡15 min，4 ℃、离心半径8 cm、12 000 r/min离心5 min。去上清液，管内沉淀静置干燥5 min，加入50 μL DEPC水溶解，分光光度计检测提取的RNA溶液浓度，每次检测取1 μL样本，检测重复3次，取平均值。各组细胞提取RNA后，按照TAKARA PrimeScript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒说明书合成cDNA，反转录条件37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。目的基因为PI3K、AKT、mTOR,甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)为内参，其引物探针购自生工生物工程(上海)股份有限公司，序列见表1。按引物说明书分别配制浓度为10 μmol/L的工作液，按照TAKARA SYBR® Premix Ex Taq试剂盒说明书在冰上配置反应体系，反应条件95 ℃ 10 min 1个循环；95 ℃ 5 s，60 ℃ 1 min 40个循环；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min 1个循环。使用PCR仪自带软件进行数据分析，按照2-ΔΔCt法计算出各组mRNA相对表达量。
目的基因引物探针序列
目的基因引物探针序列
| 引物名称 | 引物序列 | 产物长(bp) |
|---|---|---|
| PI3K | 正向引物5’-CTGCGACAGATGAGTGATGAA-3’ | 100 |
| 反向引物5’-GGAATCTAGAGAGGGCACAATC-3’ | ||
| AKT | 正向引物5’-CTTCTATGGCGCTGAGATTGT-3’ | 131 |
| 反向引物5’-GCCCGAAGTCTGTGATCTTAAT-3’ | ||
| mTOR | 正向引物5’-CTTGCCTCTGGATGAGTTCTAC-3’ | 92 |
| 反向引物5’-CCATGGTGTGATGATGAGAGAG-3’ | ||
| GAPDH | 正向引物5’-GTGGTCTCCTCTGACTTCAAC-3’ | 129 |
| 反向引物5’-CCTGTTGCTGTAGCCAAATTC-3’ |
注：PI3K为磷脂酰肌醇3-激酶；AKT为蛋白激酶B；mTOR为雷帕霉素靶体蛋白；GAPDH为甘油醛-3-磷酸脱氢酶
ΔCt＝Ct目的基因-Ct内参基因
ΔΔCt＝ΔCt耐药组或耐药DDP组或耐药miRNA-22＋DDP组或对照组-ΔCt对照组
取接种于6孔板的4组细胞，在5% CO2、37 ℃细胞培养箱中继续培养至细胞融合度达80%～90%时，弃培养基，每孔加入100 μL放射免疫沉淀试验(radio-immunoprecipitation assay, RIPA)裂解液，在冰上裂解30 min。将裂解液移至预冷的1.5 mL离心管中，4 ℃、离心半径8 cm、12 000 r/min离心5 min。将上清液转移到新的离心管中，BCA法测定样本中蛋白的含量。将各组提取蛋白分别加入含有溴酚兰的上样缓冲液按4∶1混合，沸水中煮5 min使蛋白变性。按每泳道30 ug蛋白60 V电压电泳30 min，样品进入分离胶后，改用80 V电压电泳至溴酚兰达分离胶底部即可终止电泳。0.32 mA电流转至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride, PVDF)膜2 h。PVDF膜室温下在脱脂牛奶封闭液中摇动封闭1 h。将PI3K、AKT、mTOR一抗按照1∶1 000稀释，将PVDF膜在一抗稀释液中4 ℃孵育过夜。次日用PBS加吐温20(PBS plus tween 20，TBST)在室温下脱色摇床上洗3次，每次10 min。将荧光二抗(山羊抗兔IgG异硫氰酸荧光素)按照1∶5 000稀释，将PVDF膜泡入二抗稀释液于室温下孵育2 h，用TBST在室温下脱色摇床上洗3次，每次10 min。采用Tanon ECL进行化学发光，按照试剂盒说明书操作。于Tanon凝胶成像仪下拍照，获取图片，使用Image J分析软件分析蛋白条带的灰度值，计算蛋白的相对表达量。实验重复3次，结果取平均值。
目的蛋白相对表达量＝目的蛋白灰度值/内参GAPDH灰度值
应用SPSS 20.0统计软件处理数据。服从正态或近似正态分布的计量资料以
±s表示，多组间的比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
与对照组比较，耐药DDP组、耐药miRNA-22＋DDP组吸光度均明显下降，差异均有统计学意义(P值均<0.01)；而耐药组吸光度无明显变化，差异无统计学意义(P>0.05)。耐药组、耐药DDP组、耐药miRNA-22＋DDP组吸光度呈下降趋势，组间两两比较，差异均有统计学意义(P值均<0.01)。见表2。MTT结果显示，顺铂仍能在一定程度上抑制MG-63耐药株细胞的增殖能力，而转染miRNA-22后的MG-63耐药株细胞的增殖能力进一步下降，提示miRNA-22对顺铂有协同作用。
4组细胞增殖能力的比较(
±s)
4组细胞增殖能力的比较(±s)
| 组别 | 样本数 | 吸光度 |
|---|---|---|
| 对照组 | 3 | 1.097±0.039 |
| 耐药组 | 3 | 1.157±0.065 |
| 耐药DDP组 | 3 | 0.870±0.014ab |
| 耐药miRNA-22＋DDP组 | 3 | 0.737±0.029abc |
| F值 | 67.731 | |
| P值 | <0.01 |
注：a与对照组比较，P<0.05；b与耐药组比较，P<0.05；c与耐药DDP组比较，P<0.05
与对照组比较，耐药组、耐药DDP组PI3K、AKT的相对表达量均增多，尤其以耐药组增多明显(P值均<0.01)，耐药miRNA-22＋DDP组与对照组差异均无统计学意义(P值均>0.01)；而mTOR相对表达量耐药组增高，耐药DDP组、耐药miRNA-22＋DDP组均降低，差异均有统计学意义(P值均<0.01)；耐药DDP组、耐药miRNA-22＋DDP组PI3K、AKT、mTOR的相对表达量均低于耐药组，差异均有统计学意义(P值均<0.01)，而耐药miRNA-22＋DDP组仅PI3K、mTOR的相对表达量低于耐药DDP组，差异均有统计学意义(P值均<0.01)。见表3。
4组细胞PI3K、AKT、mTOR mRNA相对表达量的比较(
±s)
4组细胞PI3K、AKT、mTOR mRNA相对表达量的比较(±s)
| 组别 | 样本数 | PI3K | AKT | mTOR |
|---|---|---|---|---|
| 对照组 | 3 | 1.000±0.028 | 1.002±0.084 | 1.000±0.035 |
| 耐药组 | 3 | 2.258±0.134a | 2.018±0.043a | 1.600±0.089a |
| 耐药DDP组 | 3 | 1.438±0.016ab | 1.355±0.109ab | 0.878±0.020ab |
| 耐药miRNA-22＋DDP组 | 3 | 1.110±0.042bc | 1.199±0.036b | 0.632±0.031abc |
| F值 | 186.951 | 21.678 | 194.963 | |
| P值 | <0.01 | <0.01 | <0.01 |
注：PI3K为磷脂酰肌醇3-激酶；AKT为蛋白激酶B；mTOR为雷帕霉素靶体蛋白；a与对照组比较，P<0.05；b与耐药组比较，P<0.05；c与耐药DDP组比较，P<0.05
与对照组比较，耐药组PI3K、AKT、mTOR蛋白的相对表达量均明显增加，耐药DDP组、耐药miRNA-22＋DDP组PI3K、AKT蛋白的相对表达量均明显降低，差异均有统计学意义(P值均<0.01)；耐药DDP组、耐药miRNA-22＋DDP组PI3K、AKT、mTOR蛋白的相对表达量均明显低于耐药组，耐药miRNA-22＋DDP组PI3K、AKT蛋白的相对表达量均明显低于耐药DDP组，差异均有统计学意义(P值均<0.01)。见表4、图1。
注：A为耐药组；B为耐药DDP组；C为耐药miRNA-22＋DDP组；PI3K为磷脂酰肌醇3-激酶；AKT为蛋白激酶B；mTOR为雷帕霉素靶体蛋白
4组细胞PI3K、AKT、mTOR蛋白相对表达量的比较(
±s)
4组细胞PI3K、AKT、mTOR蛋白相对表达量的比较(±s)
| 组别 | 样本数 | PI3K | AKT | mTOR |
|---|---|---|---|---|
| 对照组 | 3 | 0.844±0.021 | 0.957±0.010 | 0.671±0.019 |
| 耐药组 | 3 | 0.942±0.011a | 1.222±0.014a | 0.839±0.016a |
| 耐药DDP组 | 3 | 0.796±0.020ab | 0.885±0.017ab | 0.693±0.009b |
| 耐药miRNA-22＋DDP组 | 3 | 0.742±0.006abc | 0.808±0.013abc | 0.688±0.008b |
| F值 | 90.856 | 525.064 | 99.627 | |
| P值 | <0.01 | <0.01 | <0.01 |
注：PI3K为磷脂酰肌醇3-激酶；AKT为蛋白激酶B；mTOR为雷帕霉素靶体蛋白；a与对照组比较，P<0.05；b与耐药组比较，P<0.05；c与耐药DDP组比较，P<0.05
骨肉瘤是骨的原发性恶性肿瘤，尽管很少见，但它是青少年儿童中最常见的原发性恶性骨肿瘤，好发年龄为15～19岁[6]。近些年，新辅助化疗明显地提高了骨肉瘤患者生存率，但是超过1/3的患者出现了化疗的耐药性，最终导致治疗失败[7]。因此，探索其耐药机制对骨肉瘤的治疗有重要意义。目前，相关研究认为药物转运、药物代谢、药物靶点异常、信号通路异常、DNA损伤反应、细胞凋亡逃避、自噬的激活与肿瘤耐药性相关[8]。
杨豪等[9]用MTT法检测到长链非编码RNA LINC-PINT可抑制骨肉瘤细胞的增殖，促进凋亡。Wang等[10]研究显示，lncRNA TUSC7通过靶向调节miR-375，抑制骨肉瘤细胞的增殖和转移。本研究结果显示，顺铂对于耐药DDP组细胞仍有一定的治疗意义，可以使耐药株细胞的增殖能力下降，miRNA-22可以增强顺铂的治疗作用，使miRNA-22＋DDP组细胞增殖能力进一步下降；耐药组细胞的增殖能力虽然较对照组有加强的趋势，但无统计学意义，考虑与细胞培养时间较短有关，下一步本实验组拟延长MTT培养时间，做不同时间段各组细胞增殖能力检测，以明确耐药株的增殖能力变化曲线。
宋瑞鹏等[11]发现，p53基因能够通过PI3K-AKT-mTOR信号通路抑制骨肉瘤的细胞增殖、降低迁移。Duo等[12]研究表明，mTOR mRNA高表达的骨肉瘤细胞，其增殖、分化、侵袭、转移的能力显著增强，最终介导骨肉瘤产生耐药性。刘春杰等[13]认为，miR-32通过PI3K-AKT-mTOR信号通路调控骨肉瘤细胞的增殖。罗鸿斌等[14]研究结果显示，mTOR靶向药物通过干预PI3K-AKT-mTOR信号通路相关因子抑制骨肉瘤细胞的增殖。Zhang等[15]研究发现，黄酮木脂素降低了骨肉瘤细胞中AKT和mTOR的磷酸化，表明黄酮木脂素抑制PI3K-AKT-mTOR通路，诱导骨肉瘤细胞凋亡，进而降低骨肉瘤细胞增殖，一定程度上实现了抗肿瘤作用。Ma等[16]研究指出，尿路上皮相关基因1(urothelial carcinoma-associated 1, UCA1)通过PI3K-AKT-mTOR通路，实现了对骨肉瘤细胞侵袭性和转移的调控，使得UCA1成为骨肉瘤治疗的潜在靶点。以上研究表明，PI3K-AKT-mTOR信号通路在骨肉瘤细胞的治疗中发挥着重要作用，并且通过靶向药物干预该信号通路可以一定程度上抑制骨肉瘤细胞的增殖。本研究结果显示，耐药组细胞内PI3K、AKT、mTOR mRNA以及蛋白的相对表达量均较对照组有明显升高，提示PI3K-AKT-mTOR信号通路激活可能是导致骨肉瘤细胞的耐药性产生和增殖能力升高的重要因素。耐药株细胞再次用顺铂处理，细胞的增殖能力仍可有一定程度下降，细胞内PI3K、AKT、mTOR mRNA、蛋白的相对表达量也有所下降，提示即便对于耐药株细胞，顺铂仍有一定的治疗作用。
miRNA是一种小分子的RNA，在细胞内可以抑制目标基因翻译，或促使mRNA裂解，最终影响细胞内蛋白质的数量，与肿瘤的发生、发展及耐药性紧密相关[17]。因此，miRNA高表达可能增加肿瘤化疗敏感性，并可能成为逆转耐药性重要靶点之一。Zhou等[18]研究表明，高表达的miRNA-22可抑制骨肉瘤的增殖及迁移，并且增加了顺铂治疗的敏感性。本课题组的前期研究结果也同样证实了miRNA-22能明显抑制骨肉瘤细胞的增殖，增加化疗敏感性，但其具体机制仍需进一步研究[2]。本次实验结果显示，miRNA-22高表达的MG-63耐药细胞株细胞的增殖能力较对照组和耐药DDP组明显减弱，细胞内PI3K、AKT、mTOR mRNA以及蛋白的相对表达量均有下降，提示miRNA-22高表达可以增强顺铂对于耐药株细胞的治疗效果，一定程度上降低顺铂的耐药性。
综上所述，PI3K-AKT-mTOR信号通路可能是导致骨肉瘤细胞对顺铂产生耐药性的关键因素。miRNA-22通过下调PI3K-AKT-mTOR信号通路中PI3K、AKT以及mTOR的表达，抑制了骨肉瘤细胞的增殖，降低了顺铂耐药性，在一定程度上增强顺铂的化疗效果，可作为骨肉瘤辅助治疗的一个潜在靶点。由于本文仅为体外骨肉瘤细胞研究，未进行在体实验，存在一定局限性。下一步我们实验组将在动物实验研究中继续探讨其耐药性相关机制。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
